Screening jonkanaler i cancerceller
Summary
Den farmakologiska inriktningen av jonkanaler är ett lovande tillvägagångssätt för behandling av solida tumörer. Detaljerade protokoll tillhandahålls för att karakterisera jonkanalfunktionen i cancerceller och analysera effekterna av jonkanalmodulatorer på cancerlivskraft.
Abstract
Jonkanaler är avgörande för cellutveckling och upprätthållande av cellhomeostas. Störningen av jonkanalfunktionen bidrar till utvecklingen av ett brett spektrum av störningar eller kanalopatier. Cancerceller använder jonkanaler för att driva sin egen utveckling, samt att förbättra sig som tumör och att assimilera i en mikromiljö som inkluderar olika icke-cancerceller. Dessutom kan ökningar av nivåer av tillväxtfaktorer och hormoner inom tumörmikromiljön resultera i förbättrat jonkanaluttryck, vilket bidrar till cancercellsproliferation och överlevnad. Således är farmakologisk inriktning av jonkanaler potentiellt ett lovande tillvägagångssätt för behandling av solida maligniteter, inklusive primär och metastaserad hjärncancer. Här beskrivs protokoll för att karakterisera funktionen av jonkanaler i cancerceller och metoder för att analysera modulatorer av jonkanaler för att bestämma deras inverkan på cancerlivskraft. Dessa inkluderar färgning av en cell (er) för en jonkanal (er), testning av det polariserade tillståndet hos mitokondrier, etablering av jonkanalfunktion med hjälp av elektrofysiologi och utförande av livskraftsanalyser för att bedöma läkemedelsstyrka.
Introduction
Membrantransportproteiner är avgörande för kommunikation mellan celler, liksom för att upprätthålla cellulär homeostas. Bland membrantransportproteinerna tjänar jonkanaler till att driva tillväxt och utveckling av celler och för att upprätthålla cellernas tillstånd i utmanande och föränderliga miljöer. Jonkanaler har också rapporterats driva och stödja utvecklingen av solida tumörer, både systemiskt och i centrala nervsystemet (CNS)1,2. Till exempel är KCa3.1-kanaler ansvariga för att reglera membranpotentialen och kontrollera cellvolymen, vilket är viktigt vid cellcykelreglering. Defekta KCa3.1-kanaler har rapporterats bidra till onormal spridning av tumörceller3. Vidare kan jonkanaler bidra till metastaserad spridning av cancer. Övergående receptorpotential (TRP) kanaler är till exempel involverade i Ca 2+ och Mg2+ tillströmning; Denna tillströmning aktiverar flera kinaser och värmechockproteiner som fungerar för att reglera den extracellulära matrisen som omger en tumör, vilket i sin tur är viktigt för att initiera cancermetastaser4.
Eftersom jonkanaler kan bidra till utvecklingen av cancer kan de också vara måltavlor för läkemedelsrelaterad cancerbehandling. Till exempel är resistens mot behandlingsmodaliteter, inklusive kemoterapi och ny immunterapi, relaterad till jonkanalfunktionsdysregulering 5,6,7. Dessutom framträder jonkanaler som viktiga läkemedelsmål för att hindra tillväxt och utveckling av cancer, med återanvända småmolekylära (FDA-godkända) läkemedel som undersöks, liksom biopolymerer, inklusive monoklonala antikroppar 1,2,8,9. Även om det har skett stora framsteg på denna front, är jonkanalcancerläkemedelsupptäckten fortfarande underutvecklad. Detta beror delvis på de unika utmaningarna med att studera jonkanaler i cancerceller. Till exempel finns det tekniska begränsningar vid upprättandet av elektrofysiologiska analyser för långsamt verkande föreningar och tidsmässiga skillnader i kanalaktivering och läkemedelsverkan. Vidare kan lösligheten hos föreningar också hindra framsteg, eftersom de flesta av de automatiserade elektrofysiologiska system som vanligtvis används idag använder hydrofoba substrat, vilket kan bidra till artefakter som ett resultat av sammansatt adsorption. Dessutom är stora bioorganiska molekylära terapier som naturprodukter, peptider och monoklonala antikroppar tekniskt utmanande att screena med konventionella elektrofysiologiska analyser10. Slutligen förblir cancercellernas bioelektriska egenskaper dåligt förstådda11.
Samtidigt är immunofluorescensfärgning av jonkanaler ofta utmanande. Detta beror delvis på komplexiteten i deras strukturer och deras sammanhang i membranet, vilket påverkar förmågan att både generera och använda antikroppar för mikroskopistudier. Det är särskilt viktigt att antikropparna som används för att färga jonkanaler valideras för specificitet, affinitet och reproducerbarhet. Kommersiella antikroppar för jonkanaler bör övervägas baserat på deras valideringsstrategi och publikationsrekord. Experiment bör innehålla negativa kontroller för att visa bristen på ospecifik bindning genom antingen knockdown eller knockout av målproteinet. Alternativt kan cellinjer i vilka målproteinet saknas eller är i låg förekomst baserat på mRNA- eller proteinbestämningar fungera som negativa kontroller. Till exempel visar denna studie lokaliseringen av (GABA) receptorunderenheten Gabra5 i en medulloblastomcellinje (D283). D283-celler med en siRNA-knockdown och Daoy-celler, en annan cerebellär medulloblastomcellinje, färgades för Gabra5 och visade ingen märkbar färgning (data visas inte).
Här presenteras metoder för att analysera och analysera jonkanalfunktion, samt effekten av jonkanalmodulatorer på cancerceller. Protokoll tillhandahålls för (1) färgning av celler för en jonkanal, (2) testning av mitokondriernas polariserade tillstånd, (3) upprättande av jonkanalfunktion med hjälp av elektrofysiologi och (4) in vitro-läkemedelsvalidering. Dessa protokoll betonar studier av typ A gamma-aminosmörsyra (GABAA) receptor 2,12,13,14,15,16, en kloridanjonkanal och större hämmande neurotransmittorreceptor. De metoder som presenteras här gäller dock för att studera många andra cancerceller och jonkanaler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förändringar i jonkanalfunktionen förändrar intracellulära signalkaskader, vilket kan påverka cellens övergripande funktion. Under det senaste decenniet har det blivit allt tydligare att jonkanaler är viktiga för cancercellstillväxt och metastasering. Viktigt är att många jonkanaler är primära mål för godkända terapier som riktar sig mot ett brett spektrum av störningar24. Utredare har undersökt om jonkanaler kan vara anti-cancermål, och de första resultaten lovar <sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner stöd från Thomas E. &; Pamela M. Mischell Family Foundation till SS och Harold C. Schott Foundation-finansiering av Harold C. Schott Endowed Chair, UC College of Medicine, till SS
Materials
| ABS SpectraMax Plate Reader | Molecular Devices | ABS | |
| Accutase | Invitrogen | 00-4555-56 | |
| Alexa Flor 488 | Invitrogen | A32723 | Goat Anti-Rabbit |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | 100x |
| B27 Supplement | Gibco | 12587-010 | Lacks vitamin A |
| Biosafety Cabinet | LABCONCO | 302381101 | Class II, Type A2 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1606-100 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-211 | Heracell VIOS 160i |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C7902 | Dihydrate |
| Cell Culture Dishes, 150 mm | Fisher Scientific | 12-600-004 | Cell culture treated |
| Cell Culture Flasks, 75 cm2 | Fisher Scientific | 430641U | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 6 well | Fisher Scientific | 353046 | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 96 well | Fisher Scientific | 353072 | Cell culture treated |
| Centrifuge | Eppendorf | EP-5804R | Refrigerated |
| Corning CoolCell | Fisher Scientific | 07-210-0006 | |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-553-450 | Corning brand |
| D283 Med | ATCC | HTB-185 | |
| DABCO Mounting Media | EMS | 17989-97 | |
| D-Glucose | Sigma Life Sciences | D9434 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | Cell culture grade |
| DMEM/F12, base media | Fisher Scientific | 11330-032 | With phenol red |
| DMEM/F12, phenol red free | Fisher Scientific | 21041-025 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Epidermal Growth Factor | STEMCELL | 78006.1 | |
| FCCP | Abcam | AB120081 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 10437-028 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic | Millipore | GF003 | |
| GARBA5 Antibody | Aviva | ARP30687_P050 | Rabbit Polyclonal |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Glycerol Mounting Medium | EMS | 17989-60 | With DAPI+DABCO |
| Hemocytometer | Millipore Sigma | ||
| Heparin | STEMCELL | 7980 | |
| HEPES | HyClone | SH3023701 | Solution |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | Solid |
| ImageJ | Open platform | With Fiji plugins | |
| Immuno Mount DAPI | EMS | 17989-97 | |
| KRM-II-08 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | ||
| Leukemia Inhibitory Factor | Novus | N276314100U | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M9272 | Hexahydrate |
| Microscope, Confocal | Leica | SP8 | |
| Microscope, Light | VWR | 76382-982 | DMiL Inverted |
| MTS – Promega One Step | Promega | G3581 | |
| Multi-channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | Z683914 | |
| Multi-channel pipette, 10-100 µL | Eppendorf | Z683930 | |
| Multi-channel pipette, 30-300 µL | Eppendorf | Z683957 | |
| Nest-O-Patch | Heka | ||
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 10888022 | Without vitamin A |
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 12348-017 | Phenol red free |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| NOR-QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Parafilm | Fisher Scientific | 50-998-944 | 4 inch width |
| Paraformaldehyde | EMS | RT-15710 | |
| PATHCHMASTER | Heka | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perfusion System | Nanion | 4000120 | |
| PFA | EMS | RT-15710 | |
| Phosphate Bufered Saline | Fisher Scientific | AAJ75889K2 | Reagent grade |
| Poly-D-Lysine | Fisher Scientific | A3890401 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Life Sciences | P4707 | |
| Port-a-Patch | Nanion | 21000072 | |
| Potassium Chloride | Sigma Life Sciences | P5405 | |
| Primary Antibody | Invitrogen | MA5-34653 | Rabbit Monoclonal |
| Prism | GraphPad | ||
| Propofol | Fisher Scientific | NC0758676 | 1 mL ampule |
| QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-664 | Sterile |
| Slides, 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-544-7 | Frosted one side |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-Cl | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Synth-a-Freeze Medium | Gibco | R00550 | Cryopreservation |
| TMRE | Fisher Scientific | 50-196-4741 | Reagent |
| TMRE Kit | Abcam | AB113852 | Kit |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | NC0704309 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15-250-061 | Solution, 0.4% |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Solution, 0.25% |
| Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| Whatman Filter Paper | Fisher Scientific | 09-927-841 |
References
- Prevarskaya, N., Skryma, R., Shuba, Y. Ion channels in cancer: Are cancer hallmarks oncochannelopathies. Physiological Reviews. 98 (2), 559-621 (2018).
- Rao, R., et al. Ligand-gated neurotransmitter receptors as targets for treatment and management of cancers. Frontiers in Physiology. 13, 839437 (2022).
- Mohr, C. J., et al. Cancer-associated intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel KCa3.1. Cancers. 11 (1), 109 (2019).
- Fels, B., Bulk, E., Petho, Z., Schwab, A. The role of TRP channels in the metastatic cascade. Pharmaceuticals. 11 (2), 48 (2018).
- Eil, R., et al. Ionic immune suppression within the tumour microenvironment limits T cell effector function. Nature. 537 (7621), 539-543 (2016).
- Haustrate, A., Hantute-Ghesquier, A., Prevarskaya, N., Lehen’kyi, V. Monoclonal antibodies targeting ion channels and their therapeutic potential. Frontiers in Pharmacology. 10, 606 (2019).
- Kischel, P., et al. Ion channels: New actors playing in chemotherapeutic resistance. Cancers. 11 (3), 376 (2019).
- Tuszynski, J., Tilli, T. M., Levin, M. Ion channel and neurotransmitter modulators as electroceutical approaches to the control of cancer. Current Pharmaceutical Design. 23 (32), 4827-4841 (2017).
- Kale, V. P., Amin, S. G., Pandey, M. K. Targeting ion channels for cancer therapy by repurposing the approved drugs. Biochimica Biophysica Acta. 1848 (10), 2747-2755 (2015).
- Wickenden, A., Priest, B., Erdemli, G. Ion channel drug discovery: Challenges and future directions. Future Medicinal Chemistry. 4 (5), 661-679 (2012).
- Rocha, P. R. F., Elghajiji, A., Tosh, D. Ultrasensitive system for electrophysiology of cancer cell populations: A review. Bioelectricity. 1 (3), 131-138 (2019).
- Sengupta, S., et al. α5-GABAA receptors negatively regulate MYC-amplified medulloblastoma growth. Acta Neuropathologica. 127 (4), 593-603 (2014).
- Jonas, O., et al. First in vivo testing of compounds targeting Group 3 medulloblastomas using an implantable microdevice as a new paradigm for drug development. Journal of Biomedical Nanotechnology. 12 (6), 1297-1302 (2016).
- Kallay, L., et al. Modulating native GABAA receptors in medulloblastoma with positive allosteric benzodiazepine-derivatives induces cell death. Journal of Neurooncology. 142 (3), 411-422 (2019).
- Pomeranz Krummel, D. A., et al. Melanoma cell intrinsic GABAA receptor enhancement potentiates radiation and immune checkpoint response by promoting direct and T cell-mediated anti-tumor activity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 109 (4), P1040-P1053 (2021).
- Bhattacharya, D., et al. Therapeutically leveraging GABAA receptors in cancer. Experimental Biology and Medicine. 246 (19), 2128-2135 (2021).
- Mazia, D., Schatten, G., Sale, W. Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. Applications to electron microscopy. Journal of Cell Biology. 66 (1), 198-200 (1975).
- Wiatrak, B., Kubis-Kubiak, A., Piwowar, A., Barg, E. PC12 cell line: Cell types, coating of culture vessels, differentiation and other culture conditions. Cells. 9 (4), 958 (2020).
- Baker, J. R. Fixation in cytochemistry and electron-microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 6 (5), 303-308 (1958).
- Chung, J. Y., et al. Histomorphological and molecular assessments of the fixation times comparing formalin and ethanol-based fixatives. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (2), 121-135 (2018).
- Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
- Cory, A. H., Owen, T. C., Barltrop, J. A., Cory, J. G. Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture. Cancer Communications. 3 (7), 207-212 (1991).
- Maro, B., Marty, M. C., Bornens, M. In vivo and in vitro effects of the mitochondrial uncoupler FCCP on microtubules. EMBO Journal. 1 (11), 1347-1352 (1982).
- Zheng, J., et al. Mechanism for regulation of melanoma cell death via activation of thermo-TRPV4 and TRPV. Journal of Oncology. 2019, 7362875 (2019).
- Konno, K., Watanabe, M., Luján, R., Ciruela, F. Immunohistochemistry for ion channels and their interacting molecules: Tips for improving antibody accessibility. Receptor and Ion Channel Detection in the Brain. , (2016).
- Mortensen, M., Smart, T. G. Single-channel recording of ligand-gated ion channels. Nature Protocols. 2 (11), 2826-2841 (2007).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Rafehi, H., et al. Clonogenic assay: Adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (49), 2573 (2011).
- Scudiero, D. A., et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Research. 48 (17), 4827-4833 (1988).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, e10202 (2010).
- Berridge, M. V., Tan, A. S. Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Archives of Biochemistry and Biophysics. 303 (2), 474-482 (1993).
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Research. 49 (16), 4435-4440 (1989).
- Chakrabarti, R., Kundu, S., Kumar, S., Chakrabarti, R. Vitamin A as an enzyme that catalyzes the reduction of MTT to formazan by vitamin C. Journal of Cellular Biochemistry. 80 (1), 133-138 (2000).
- Dong, G. W., Preisler, H. D., Priore, R. Potential limitations of in vitro clonogenic drug sensitivity assays. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 13 (3), 206-210 (1984).
- Sun, J., et al. STIM1- and Orai1-Mediated Ca2+oscillation orchestrates invadopodium formation and melanoma invasion. Journal of Cell Biology. 207 (4), 535-548 (2014).
