التنميط الجيني وفحص التسرب على نطاق الجينوم لتحديد الأهداف العلاجية في نماذج الفئران لورم غمد العصب المحيطي الخبيث
Summary
لقد طورنا نهجا مقارنا لعلم الأورام الجيني عبر الأنواع باستخدام التحليلات الجينومية والشاشات الجينومية الوظيفية لتحديد ومقارنة الأهداف العلاجية في الأورام الناشئة في نماذج الفئران المعدلة وراثيا ونوع الورم البشري المقابل.
Abstract
أورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة (MPNSTs) مشتقة من خلايا شوان أو سلائفها. في المرضى الذين يعانون من متلازمة حساسية الورم الورم العصبي الليفي من النوع 1 (NF1) ، تعد MPNSTs أكثر الأورام الخبيثة شيوعا والسبب الرئيسي للوفاة. توفر ساركوما الأنسجة الرخوة النادرة والعدوانية هذه مستقبلا صارخا ، مع معدلات بقاء خالية من الأمراض لمدة 5 سنوات تتراوح بين 34-60٪. خيارات العلاج للأفراد الذين يعانون من MPNSTs محدودة بشكل مخيب للآمال ، مع كون الجراحة المشوهة هي خيار العلاج الأول. العديد من العلاجات التي كانت واعدة في يوم من الأيام مثل tipifarnib ، وهو مثبط لإشارات Ras ، فشلت سريريا. وبالمثل ، فشلت التجارب السريرية للمرحلة الثانية مع erlotinib ، الذي يستهدف عامل نمو البشرة (EFGR) ، و sorafenib ، الذي يستهدف مستقبل عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) ، ومستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF) ، و Raf ، بالاشتراك مع العلاج الكيميائي القياسي ، في إنتاج استجابة في المرضى.
في السنوات الأخيرة ، أثبتت طرق الفحص الجينومي الوظيفي جنبا إلى جنب مع التنميط الجيني لخطوط الخلايا السرطانية أنها مفيدة لتحديد مسارات الإشارات السيتوبلازمية الأساسية وتطوير علاجات محددة الهدف. في حالة أنواع الأورام النادرة ، يتم استخدام شكل مختلف من هذا النهج المعروف باسم علم الأورام الجيني المقارن عبر الأنواع بشكل متزايد لتحديد أهداف علاجية جديدة. في علم الأورام الجيني المقارن عبر الأنواع ، يتم إجراء التنميط الجيني وعلم الجينوم الوظيفي في نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEM) ثم يتم التحقق من صحة النتائج في العينات البشرية النادرة وخطوط الخلايا المتاحة.
تصف هذه الورقة كيفية تحديد طفرات الجينات الدافعة المرشحة في خلايا MPNST البشرية والفأر باستخدام تسلسل الإكسوم الكامل (WES). ثم نصف كيفية إجراء شاشات shRNA على نطاق الجينوم لتحديد ومقارنة مسارات الإشارات الحرجة في خلايا MPNST للفأر والإنسان وتحديد الأهداف القابلة للدواء في هذه المسارات. توفر هذه المنهجيات نهجا فعالا لتحديد أهداف علاجية جديدة في مجموعة متنوعة من أنواع السرطان البشري.
Introduction
أورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة (MPNSTs) هي أورام خلايا المغزل شديدة العدوانية التي تنشأ بالاقتران مع متلازمة حساسية الورم العصبي الليفي من النوع 1 (NF1) ، بشكل متقطع في عموم السكان وفي مواقع العلاج الإشعاعي السابق1،2،3. يولد مرضى NF1 بنسخة من النوع البري من جين مثبط الورم NF1 وأليل NF1 ثان مع طفرة فقدان الوظيفة. هذه الحالة من عدم كفاية الفرداني تجعل مرضى NF1 عرضة لطفرة ثانية في فقدان الوظيفة في جين NF1 من النوع البري ، مما يؤدي إلى تكوين الأورام. عندما تحدث طفرة NF1 “الضربة الثانية” هذه في خلية في سلالة خلايا شوان ، يكون الورم الناتج إما ورم ليفي عصبي جلدي ينشأ في الجلد أو ورم ليفي عصبي ضفيري يتطور في الأعصاب الكبيرة أو الضفائر العصبية. على الرغم من أن أمراض الأورام الليفية العصبية الجلدية والضفيرية متطابقة ، إلا أن سلوكها البيولوجي مختلف تماما – على الرغم من أن كل من الأورام الليفية العصبية الجلدية والضفيرية حميدة ، إلا أن الأورام الليفية العصبية الضفيرية فقط هي التي يمكن أن تخضع للتحول وتؤدي إلى MPNSTs. بالإضافة إلى فقدان neurofibromin ، البروتين المنشط Ras GTPase المشفر بواسطة جين NF1 ، تحمل MPNSTs طفرات في العديد من الجينات الكابتة للورم الأخرى ، بما في ذلك TP534،5،6،7 و CDKN2A8،9 و PTEN 10 ، طفرات الجينات التي تشفر مكونات مجمع polycomb القمعي 2 11,12 (PRC2 ؛ ال SUZ12 وجينات EED) والتعبير الشاذ عن مستقبلات التيروزينكينازات 1،2. طفرات NF1 والجينات الأخرى المذكورة أعلاه موجودة أيضا في MPNSTs المتفرقة والناجمة عن الإشعاع11,12.
في حين أن هذه التطورات في فهمنا للتشوهات الجينومية في MPNSTs كانت لا تقدر بثمن لفهم التسبب في المرض ، إلا أنها لم تسفر بعد عن تطوير علاجات جديدة فعالة ل MPNSTs. أحد العوائق الرئيسية التي تعوق تطوير علاجات جديدة هو حقيقة أن MPNSTs هي سرطانات نادرة. ولهذا السبب، من الصعب الحصول على العدد الكبير من عينات المرضى المطلوبة للتحليلات العالمية التي تحدد طفرات المحرك الرئيسية مثل تلك التي يقوم بها أطلس جينوم السرطان (TCGA). في تجربتنا ، قد يستغرق تجميع حتى عدد متواضع من عينات MPNST البشرية سنوات. للتغلب على هذه القيود ، تحول العديد من الباحثين الذين يدرسون أنواعا أخرى من السرطان النادر إلى استخدام علم الأورام الجيني المقارن عبر الأنواع لتحديد الطفرات الجينية الأساسية للمحرك ، وتحديد مسارات الإشارات السيتوبلازمية الأساسية في الورم محل الاهتمام ، وتحديد أهداف علاجية جديدة. نظرا لأن مسارات الإشارات الضرورية لتكوين الأورام محفوظة بشكل كبير بين البشر وأنواع الفقاريات الأخرى ، فإن تطبيق مناهج الجينوم الوظيفي مثل شاشات shRNA على نطاق الجينوم يمكن أن يكون وسيلة فعالة لتحديد هذه الطفرات الدافعة الجديدة ، ومسارات الإشارات ، والأهداف العلاجية 13،14،15،16،17،18،19، خاصة عند دراسة أنواع الأورام البشرية النادرة المتوفرة في أعداد محدودة20.
في المنهجيات المقدمة هنا ، نصف هذا النهج لأداء التنميط الجينومي في خطوط خلايا MPNST البشرية ومزارع MPNST المبكرة المشتقة من الفئران P 0-GGFβ3 ، وهو نموذج فأر معدل وراثيا (GEM) حيث يعزز التعبير المفرط لخلية شوان لعامل النمو neuregulin-1 (NRG1) التسبب في الأورام الليفية العصبية الضفيرية وتطورها اللاحق إلى MPNSTs21 ، 22,23. تتمثل الخطوة الأولى في هذا النهج في تحديد جينات المحرك المرشحة في P 0-GGFβ3 MPNSTs ، وخطوط خلايا MPNST البشرية ، و MPNSTs البشرية التي تم استئصالها جراحيا. للتحقق وظيفيا من مسارات الإشارات المتأثرة بهذه الطفرات ، نستخدم بعد ذلك شاشات shRNA على نطاق الجينوم لتحديد الجينات المطلوبة للتكاثر والبقاء في خطوط خلايا MPNST البشرية والفئران. بعد تحديد الجينات المطلوبة للتكاثر والبقاء على قيد الحياة ، نحدد بعد ذلك منتجات الجينات القابلة للدواء ضمن مجموعة “الزيارات” باستخدام قاعدة بيانات التفاعل الجيني الدوائي. نقارن أيضا “الزيارات” في خلايا MPNST البشرية والفأر ، لتحديد ما إذا كان نموذج GEM و MPNSTs البشرية يظهران اعتمادا مشابها على نفس الجينات ومسارات الإشارة. يعمل تحديد التداخلات في الجينات المطلوبة للتكاثر والبقاء ومسارات الإشارات المتأثرة كوسيلة للتحقق من صحة نموذج الماوس P 0-GGFβ3 على المستوى الجزيئي. يؤكد هذا النهج أيضا على فعالية الجمع بين شاشات الإنسان والماوس لتحديد أهداف علاجية جديدة ، حيث يمكن أن يكون نموذج الماوس بمثابة مكمل للشاشات البشرية. تتضح قيمة هذا النهج عبر الأنواع بشكل خاص عند البحث عن أهداف علاجية في الأورام النادرة ، حيث يصعب الحصول على الأورام البشرية وخطوط الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تطوير الطرق التفصيلية المعروضة هنا لدراسة أورام الجهاز العصبي المحيطي والتسبب في MPNST. على الرغم من أننا وجدنا أن هذه الطرق فعالة ، إلا أنه يجب الاعتراف بوجود بعض القيود المحتملة على الطرق التي نصفها هنا. أدناه ، نناقش بعض هذه القيود والاستراتيجيات المحتملة للتغلب عليها في أنظمة نموذجية…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بمنح من المعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية (R01 NS048353 و R01 NS109655 إلى S.L.C. ؛ R01 NS109655-03S1 إلى D.P.J.) ، والمعهد الوطني للسرطان (R01 CA122804 إلى S.L.C.) ، ووزارة الدفاع (X81XWH-09-1-0086 و W81XWH-12-1-0164 إلى S.L.C.)
Materials
| Bioruptor Sonication System | Diagenode | UCD-600 | |
| CASAVA 1.8.2 | |||
| Cbot | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software | |||
| Citrisolve Hybrid | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Corning 96-well Black Microplate | Millipore Sigma | CLS3603 | |
| Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes | Diagenode | C30010009 | |
| dNTP mix | Clontech | 639210 | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Elution buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’ | |||
| FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’ | |||
| GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’ | HPLC purified | ||
| GraphPad Prism | Dotmatics | ||
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Illumina HiScanSQ | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| PLUS Transfection Reagent | Thermo Scientific | 11514015 | |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR1003G | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Qiagen Buffer P1 | Qiagen | 19051 | |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’ | |||
| RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’ | |||
| Titanium Taq polymerase | Clontech | 639210 | |
| Trimmomatic software | www.usadellab.org |
References
- Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).
- Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent Advances in the Diagnosis and Pathogenesis of Neurofibromatosis Type 1 (NF1)-associated Peripheral Nervous System Neoplasms. Adv Anat Pathol. 25 (5), 353-368 (2018).
- Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Adv Cancer Res. 153, 305-341 (2022).
- Birindelli, S., et al. Rb and TP53 pathway alterations in sporadic and NF1-related malignant peripheral nerve sheath tumors. Lab Invest. 81 (6), 833-844 (2001).
- Legius, E., et al. TP53 mutations are frequent in malignant NF1 tumors. Genes Chromosomes Cancer. 10 (4), 250-255 (1994).
- Menon, A. G., et al. Chromosome 17p deletions and p53 gene mutations associated with the formation of malignant neurofibrosarcomas in von Recklinghausen neurofibromatosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (14), 5435-5439 (1990).
- Upadhyaya, M., et al. Germline and somatic NF1 gene mutation spectrum in NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs). Hum Mutat. 29 (1), 74-82 (2008).
- Kourea, H. P., Orlow, I., Scheithauer, B. W., Cordon-Cardo, C., Woodruff, J. M. Deletions of the INK4A gene occur in malignant peripheral nerve sheath tumors but not in neurofibromas. Am J Pathol. 155 (6), 1855-1860 (1999).
- Nielsen, G. P., et al. Malignant transformation of neurofibromas in neurofibromatosis 1 is associated with CDKN2A/p16 inactivation. Am J Pathol. 155 (6), 1879-1884 (1999).
- Gregorian, C., et al. PTEN dosage is essential for neurofibroma development and malignant transformation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (46), 19479-19484 (2009).
- Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1227-1232 (2014).
- Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1170-1172 (2014).
- Varela, I., et al. Somatic structural rearrangements in genetically engineered mouse mammary tumors. Genome Biol. 11 (10), 100 (2010).
- Johnson, R. A., et al. Cross-species genomics matches driver mutations and cell compartments to model ependymoma. Nature. 466 (7306), 632-636 (2010).
- Kim, M., et al. Comparative oncogenomics identifies NEDD9 as a melanoma metastasis gene. Cell. 125 (7), 1269-1281 (2006).
- Zender, L., et al. Identification and validation of oncogenes in liver cancer using an integrative oncogenomic approach. Cell. 125 (7), 1253-1267 (2006).
- Uren, A. G., et al. Large-scale mutagenesis in p19(ARF)- and p53-deficient mice identifies cancer genes and their collaborative networks. Cell. 133 (4), 727-741 (2008).
- Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323 (5922), 1747-1750 (2009).
- Dupuy, A. J., et al. A modified sleeping beauty transposon system that can be used to model a wide variety of human cancers in mice. Cancer Res. 69 (20), 8150-8156 (2009).
- Carroll, S. L. The Challenge of Cancer Genomics in Rare Nervous System Neoplasms: Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors as a Paradigm for Cross-Species Comparative Oncogenomics. Am J Pathol. 186 (3), 464-477 (2016).
- Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. J Neurosci. 23 (19), 7269-7280 (2003).
- Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. Am J Pathol. 182 (3), 646-667 (2013).
- Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathol. 127 (4), 573-591 (2014).
- Hart, T., Brown, K. R., Sircoulomb, F., Rottapel, R., Moffat, J. Measuring error rates in genomic perturbation screens: gold standards for human functional genomics. Mol Syst Biol. 10 (7), 733 (2014).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens. G3. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Sci Rep. 11 (1), 5690 (2021).
- Maser, R. S., et al. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447 (7147), 966-971 (2007).
- Rahrmann, E. P., et al. Forward genetic screen for malignant peripheral nerve sheath tumor formation identifies new genes and pathways driving tumorigenesis. Nat Genet. 45 (7), 756-766 (2013).
