Method Article

التنميط الجيني وفحص التسرب على نطاق الجينوم لتحديد الأهداف العلاجية في نماذج الفئران لورم غمد العصب المحيطي الخبيث

DOI:

10.3791/65430

⸱

August 25th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 3Department of Computational Medicine and Bioinformatics, University of Michigan, Ann Arbor

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد طورنا نهجا مقارنا لعلم الأورام الجيني عبر الأنواع باستخدام التحليلات الجينومية والشاشات الجينومية الوظيفية لتحديد ومقارنة الأهداف العلاجية في الأورام الناشئة في نماذج الفئران المعدلة وراثيا ونوع الورم البشري المقابل.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة (MPNSTs) مشتقة من خلايا شوان أو سلائفها. في المرضى الذين يعانون من متلازمة حساسية الورم الورم العصبي الليفي من النوع 1 (NF1) ، تعد MPNSTs أكثر الأورام الخبيثة شيوعا والسبب الرئيسي للوفاة. توفر ساركوما الأنسجة الرخوة النادرة والعدوانية هذه مستقبلا صارخا ، مع معدلات بقاء خالية من الأمراض لمدة 5 سنوات تتراوح بين 34-60٪. خيارات العلاج للأفراد الذين يعانون من MPNSTs محدودة بشكل مخيب للآمال ، مع كون الجراحة المشوهة هي خيار العلاج الأول. العديد من العلاجات التي كانت واعدة في يوم من الأيام مثل tipifarnib ، وهو مثبط لإشارات Ras ، فشلت سريريا. وبالمثل ، فشلت التجارب السريرية للمرحلة الثانية مع erlotinib ، الذي يستهدف عامل نمو البشرة (EFGR) ، و sorafenib ، الذي يستهدف مستقبل عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) ، ومستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF) ، و Raf ، بالاشتراك مع العلاج الكيميائي القياسي ، في إنتاج استجابة في المرضى.

في السنوات الأخيرة ، أثبتت طرق الفحص الجينومي الوظيفي جنبا إلى جنب مع التنميط الجيني لخطوط الخلايا السرطانية أنها مفيدة لتحديد مسارات الإشارات السيتوبلازمية الأساسية وتطوير علاجات محددة الهدف. في حالة أنواع الأورام النادرة ، يتم استخدام شكل مختلف من هذا النهج المعروف باسم علم الأورام الجيني المقارن عبر الأنواع بشكل متزايد لتحديد أهداف علاجية جديدة. في علم الأورام الجيني المقارن عبر الأنواع ، يتم إجراء التنميط الجيني وعلم الجينوم الوظيفي في نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEM) ثم يتم التحقق من صحة النتائج في العينات البشرية النادرة وخطوط الخلايا المتاحة.

تصف هذه الورقة كيفية تحديد طفرات الجينات الدافعة المرشحة في خلايا MPNST البشرية والفأر باستخدام تسلسل الإكسوم الكامل (WES). ثم نصف كيفية إجراء شاشات shRNA على نطاق الجينوم لتحديد ومقارنة مسارات الإشارات الحرجة في خلايا MPNST للفأر والإنسان وتحديد الأهداف القابلة للدواء في هذه المسارات. توفر هذه المنهجيات نهجا فعالا لتحديد أهداف علاجية جديدة في مجموعة متنوعة من أنواع السرطان البشري.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة (MPNSTs) هي أورام خلايا المغزل شديدة العدوانية التي تنشأ بالاقتران مع متلازمة حساسية الورم العصبي الليفي من النوع 1 (NF1) ، بشكل متقطع في عموم السكان وفي مواقع العلاج الإشعاعي السابق1،2،3. يولد مرضى NF1 بنسخة من النوع البري من جين مثبط الورم NF1 وأليل NF1 ثان مع طفرة فقدان الوظيفة. هذه الحالة من عدم كفاية الفرداني تجعل مرضى NF1 عرضة لطفرة ثانية في فقدان الوظيفة في جين NF1 من النوع البري ، مما يؤدي إلى تكوين الأورام. عندما تحدث طفرة NF1 "الضربة الثانية" هذه في خلية في سلالة خلايا شوان ، يكون الورم الناتج إم....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قبل الشروع في الدراسات ، تمت مراجعة الإجراءات والبروتوكولات الحيوانية للتعامل مع النواقل الفيروسية والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) واللجنة المؤسسية للسلامة الأحيائية (IBC). تمت الموافقة على الإجراءات الموضحة هنا من قبل مجالس IACUC و IBC بجامعة ساوث كارولينا الطبية وتم تنفيذها من قبل موظفين مدربين تدريبا مناسبا وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر وإرشادات رعاية المؤسسية الخاصة ب MUSC.

1. تحليلات WES-Seq وتحديد المتغيرات المسببة للأمراض

  1. عزل الحمض النووي الجينومي من عينة الورم أو خلايا MPNST الفرعية (70٪) المزروعة على طبق 60 مم ، باستخدام الطرق القياسية القائمة على ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعرض مخططات الشكل 5 درجات استنفاد الجينات الأساسية الأساسية (CEGs) المصنفة على أنها TRUE مقارنة بغير CEGs (المسمى FALSE) في كل خط خلية بشرية تم فحصه. تمثل النقاط log2 من درجات استنفاد الطيات للجينات الفردية ، والتي يتم رسمها على تمثيل boxplot لتوزيع النتيجة الإجمالي. تم استخدام اختبار t للطالب لاختبار وجود فرق كبير في متوسط درجات النضوب بين المجموعتين في كل خط خلوي. يشار إلى قيم p الناتجة في كل لوحة. لاحظ أن متوسط درجات استنفاد الطيات أعلى بكثير بالنسبة ل CEGs من غير CEGs. .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير الطرق التفصيلية المعروضة هنا لدراسة أورام الجهاز العصبي المحيطي والتسبب في MPNST. على الرغم من أننا وجدنا أن هذه الطرق فعالة ، إلا أنه يجب الاعتراف بوجود بعض القيود المحتملة على الطرق التي نصفها هنا. أدناه ، نناقش بعض هذه القيود والاستراتيجيات المحتملة للتغلب عليها في أنظمة نموذجية أخرى.

لقد وجدنا أن تسلسل الإكسوم الكامل يحدد بشكل فعال الطفرات ذات الأهمية في الفئران P 0-GGFβ3. ومع ذلك ، يجب الاعتراف بأن تسلسل الإكسوم بأكمله له حدود. أولا ، لا يعد تسلسل الإكسوم الكامل نهجا ف.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بمنح من المعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية (R01 NS048353 و R01 NS109655 إلى S.L.C. ؛ R01 NS109655-03S1 إلى D.P.J.) ، والمعهد الوطني للسرطان (R01 CA122804 إلى S.L.C.) ، ووزارة الدفاع (X81XWH-09-1-0086 و W81XWH-12-1-0164 إلى S.L.C.)

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
نظام صوتنة BioruptorDiagenode UCD-600
CASAVA 1.8.2
CbotIllumina ، سان دييغو ، CAN / A
CELIGO IMAGE CELLULARNEXCELOMN / A
Cellecta Barcode Analyzer وبرنامج
Citrisolve HybridDecon Laboratories5989-27-5
Corning 96-well Black MicroplateMillipore SigmaCLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml أنابيب مخروطيةDiagenode   ؛C30010009
dNTP mixClontech639210
Eosin YThermo Scientific7111
Elution bufferQiagen   ؛19086
الإيثانول (200 برهان)مختبرات ديكون2716
Excel Microsoft 
FWDGEX 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3'
FWDHTS 5'-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3'
GexSeqS (5 بوصات) AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3 'HPLC المنقى
GraphPad PrismDotmatics
Harris HematoxylinFisherbrand245-677
Illumina HiScanSQIllumina ، سان دييغو ، CAN / A
PARAFORMALDEHYDE (4٪)Thermo ScientificJ19943-K2
PLUS كاشف الإرسالالحراري العلمي11514015
كاشف تعداء البوليبرينMillipore SigmaTR1003G
PureLink Quick PCR Purification KitInvitrogenK310001
Qiagen Buffer P1Qiagen  19051
طقم استخراج جل QiagenQiagen28704
RevGEX 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3'
RevHTS1 5'-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3'
التيتانيوم Taq polymeraseClontech639210
برنامجwww.usadellab.org
Deconvoluter Trimmomatic

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Genetic ProfilingDropout ScreeningMalignant Peripheral Nerve Sheath TumorMouse Tumor ModelsshRNA ScreeningWhole Exome SequencingFunctional GenomicsLentiviral TransductionCell Proliferation AssayTherapeutic Target Identification

Related Articles