Profilazione genetica e screening dell'abbandono su scala genomica per identificare bersagli terapeutici in modelli murini di tumore maligno della guaina nervosa periferica
Summary
Abbiamo sviluppato un approccio oncogenomico comparativo cross-species utilizzando analisi genomiche e screening genomici funzionali per identificare e confrontare bersagli terapeutici nei tumori che insorgono in modelli murini geneticamente modificati e il corrispondente tipo di tumore umano.
Abstract
I tumori maligni della guaina dei nervi periferici (MPNST) derivano dalle cellule di Schwann o dai loro precursori. Nei pazienti con sindrome da suscettibilità tumorale neurofibromatosi di tipo 1 (NF1), le MPNST sono la neoplasia maligna più comune e la principale causa di morte. Questi sarcomi dei tessuti molli, rari e aggressivi, offrono un futuro difficile, con tassi di sopravvivenza libera da malattia a 5 anni del 34-60%. Le opzioni terapeutiche per gli individui affetti da MPNST sono deludentemente limitate, con la chirurgia deturpante che è l’opzione di trattamento principale. Molte terapie un tempo promettenti come il tipifarnib, un inibitore della segnalazione Ras, hanno fallito clinicamente. Allo stesso modo, anche gli studi clinici di fase II con erlotinib, che ha come bersaglio il fattore di crescita epidermico (EFGR), e sorafenib, che ha come bersaglio il recettore del fattore di crescita dell’endotelio vascolare (VEGF), il recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) e Raf, in combinazione con la chemioterapia standard, non sono riusciti a produrre una risposta nei pazienti.
Negli ultimi anni, i metodi di screening genomico funzionale combinati con la profilazione genetica delle linee cellulari tumorali si sono dimostrati utili per identificare le vie di segnalazione citoplasmatiche essenziali e lo sviluppo di terapie specifiche per il bersaglio. Nel caso di tipi di tumori rari, una variante di questo approccio, nota come oncogenomica comparativa cross-species, viene sempre più utilizzata per identificare nuovi bersagli terapeutici. Nell’oncogenomica comparativa interspecie, la profilazione genetica e la genomica funzionale vengono eseguite in modelli murini geneticamente modificati (GEM) e i risultati vengono quindi convalidati nei rari campioni umani e nelle linee cellulari disponibili.
Questo articolo descrive come identificare le mutazioni del gene driver candidato nelle cellule MPNST umane e murine utilizzando il sequenziamento dell’intero esoma (WES). Descriviamo quindi come eseguire screening shRNA su scala genomica per identificare e confrontare le vie di segnalazione critiche nelle cellule MPNST di topo e umane e identificare bersagli farmacologici in queste vie. Queste metodologie forniscono un approccio efficace per identificare nuovi bersagli terapeutici in una varietà di tipi di cancro umano.
Introduction
I tumori maligni della guaina dei nervi periferici (MPNST) sono neoplasie a cellule fusiformi altamente aggressive che insorgono in associazione con la sindrome da suscettibilità tumorale neurofibromatosi di tipo 1 (NF1), sporadicamente nella popolazione generale e nei siti di precedente radioterapia 1,2,3. I pazienti affetti da NF1 nascono con una copia wild-type del gene oncosoppressore NF1 e un secondo allele NF1 con una mutazione con perdita di funzione. Questo stato di aploinsufficienza rende i pazienti affetti da NF1 suscettibili a una seconda mutazione con perdita di funzione nel loro gene NF1 wild-type, che innesca la tumorigenesi. Quando questa mutazione NF1 “di secondo colpo” si verifica in una cellula della linea cellulare di Schwann, il tumore risultante è un neurofibroma dermico che insorge nella pelle o un neurofibroma plessiforme che si sviluppa in grandi nervi o plessi nervosi. Sebbene la patologia dei neurofibromi dermici e plessiformi sia identica, il loro comportamento biologico è molto diverso: sebbene sia i neurofibromi dermici che quelli plessiformi siano benigni, solo i neurofibromi plessiformi possono subire una trasformazione e dare origine a MPNST. Oltre alla perdita di neurofibromina, la proteina attivante la Ras GTPasi codificata dal gene NF1, le MPNST sono portatrici di mutazioni di molti altri geni oncosoppressori, tra cui TP53 4,5,6,7, CDKN2A 8,9 e PTEN 10, mutazioni di geni che codificano componenti del complesso repressivo polycomb 2 11,12 (PRC2 ; geni SUZ12 e EED) e l’espressione aberrante dei recettori tirosin-chinasici 1,2. Mutazioni di NF1 e degli altri geni sopra menzionati sono presenti anche nelle MPNST sporadiche e indotte da radiazioni11,12.
Sebbene questi progressi nella nostra comprensione delle anomalie genomiche nelle MPNST siano stati preziosi per la comprensione della loro patogenesi, non hanno ancora portato allo sviluppo di nuove terapie efficaci per le MPNST. Uno dei principali ostacoli che ostacolano lo sviluppo di nuovi trattamenti è il fatto che gli MPNST sono tumori rari. Per questo motivo, è difficile ottenere il gran numero di campioni di pazienti necessari per le analisi globali che definiscono le mutazioni chiave come quelle intraprese dal Cancer Genome Atlas (TCGA). In base alla nostra esperienza, l’accumulo anche di un numero modesto di campioni umani di MPNST può richiedere anni. Per superare tali limitazioni, molti ricercatori che studiano altri tipi di cancro rari si sono rivolti all’uso dell’oncogenomica comparativa interspecie per identificare le mutazioni geniche driver essenziali, definire le vie di segnalazione citoplasmatiche essenziali nel loro tumore di interesse e identificare nuovi bersagli terapeutici. Poiché le vie di segnalazione essenziali per la tumorigenesi sono altamente conservate tra gli esseri umani e altre specie di vertebrati, l’applicazione di approcci di genomica funzionale come gli screening shRNA su scala genomica può essere un mezzo efficace per identificare queste nuove mutazioni driver, vie di segnalazione e bersagli terapeutici 13,14,15,16,17,18,19 , in particolare quando si studiano tipi di tumori umani rari che sono disponibili in numero limite20.
Nelle metodologie qui presentate, descriviamo questo approccio per eseguire la profilazione genomica in linee cellulari umane di MPNST e colture di MPNST di passaggio precoce derivate da topi P 0-GGFβ3, un modello murino geneticamente modificato (GEM) in cui la sovraespressione specifica delle cellule di Schwann del fattore di crescita neuregulina-1 (NRG1) promuove la patogenesi dei neurofibromi plessiformi e la loro successiva progressione verso MPNSTs21, 22,23. Il primo passo in questo approccio consiste nell’identificare i geni driver candidati nelle MPNST P 0-GGFβ3, nelle linee cellulari umane MPNST e nelle MPNST umane resecate chirurgicamente. Per convalidare funzionalmente le vie di segnalazione influenzate da queste mutazioni, utilizziamo quindi screening shRNA su scala genomica per identificare i geni necessari per la proliferazione e la sopravvivenza in linee cellulari MPNST umane e murine. Dopo aver identificato i geni necessari per la proliferazione e la sopravvivenza, identifichiamo i prodotti genici farmacologici all’interno della raccolta di “hit” utilizzando il Drug Gene Interaction Database. Confrontiamo anche gli “hit” nelle cellule MPNST umane e murine, per determinare se il modello GEM e le MPNST umane dimostrano una dipendenza simile dagli stessi geni e vie di segnalazione. L’identificazione delle sovrapposizioni nei geni necessari per la proliferazione e la sopravvivenza e le vie di segnalazione interessate serve come mezzo per convalidare il modello murino P 0-GGFβ3 a livello molecolare. Questo approccio sottolinea anche l’efficacia della combinazione di schermi umani e murini per identificare nuovi bersagli terapeutici, in cui il modello murino può fungere da complemento agli schermi umani. Il valore di questo approccio interspecie è particolarmente evidente quando si cercano bersagli terapeutici nei tumori rari, dove i tumori umani e le linee cellulari sono difficili da ottenere.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi dettagliati qui presentati sono stati sviluppati per studiare la neoplasia del sistema nervoso periferico e la patogenesi della MPNST. Sebbene abbiamo riscontrato l’efficacia di questi metodi, è necessario riconoscere che esistono alcune potenziali limitazioni ai metodi descritti in questa sede. Di seguito, discutiamo alcune di queste limitazioni e le potenziali strategie per superarle in altri sistemi modello.
Abbiamo scoperto che il sequenziamento dell’intero esoma identifica effic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 e R01 NS109655 a S.L.C.; R01 NS109655-03S1 a D.P.J.), il National Cancer Institute (R01 CA122804 a S.L.C.) e il Dipartimento della Difesa (X81XWH-09-1-0086 e W81XWH-12-1-0164 a S.L.C.).
Materials
| Bioruptor Sonication System | Diagenode | UCD-600 | |
| CASAVA 1.8.2 | |||
| Cbot | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software | |||
| Citrisolve Hybrid | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Corning 96-well Black Microplate | Millipore Sigma | CLS3603 | |
| Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes | Diagenode | C30010009 | |
| dNTP mix | Clontech | 639210 | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Elution buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’ | |||
| FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’ | |||
| GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’ | HPLC purified | ||
| GraphPad Prism | Dotmatics | ||
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Illumina HiScanSQ | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| PLUS Transfection Reagent | Thermo Scientific | 11514015 | |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR1003G | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Qiagen Buffer P1 | Qiagen | 19051 | |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’ | |||
| RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’ | |||
| Titanium Taq polymerase | Clontech | 639210 | |
| Trimmomatic software | www.usadellab.org |
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