Genetisk profilering og genomskala frafallsscreening for å identifisere terapeutiske mål i musemodeller av ondartet perifer nerveskjede tumor

Summary

Vi har utviklet en komparativ onkogenomisk tilnærming på tvers av arter som bruker genomiske analyser og funksjonelle genomiske skjermer for å identifisere og sammenligne terapeutiske mål i svulster som oppstår i genetisk konstruerte musemodeller og den tilsvarende humane tumortypen.

Abstract

Ondartede perifere nerveskjede svulster (MPNST) er avledet fra Schwann-celler eller deres forløpere. Hos pasienter med tumorfølsomhetssyndromet nevrofibromatose type 1 (NF1) er MPNST den vanligste maligniteten og den viktigste dødsårsaken. Disse sjeldne og aggressive bløtvevsarkomene tilbyr en sterk fremtid, med 5-års sykdomsfri overlevelse på 34-60%. Behandlingsmuligheter for personer med MPNST er skuffende begrenset, med skjemmende kirurgi som det fremste behandlingsalternativet. Mange en gang lovende terapier som tipifarnib, en hemmer av Ras-signalering, har mislyktes klinisk. På samme måte har fase II kliniske studier med erlotinib, som retter seg mot epidermal vekstfaktor (EFGR), og sorafenib, som retter seg mot vaskulær endotelial vekstfaktorreseptor (VEGF), blodplateavledet vekstfaktorreseptor (PDGF) og Raf, i kombinasjon med standard kjemoterapi, heller ikke gitt respons hos pasienter.

I de senere år har funksjonelle genomiske screeningsmetoder kombinert med genetisk profilering av kreftcellelinjer vist seg nyttige for å identifisere viktige cytoplasmatiske signalveier og utvikling av målspesifikke terapier. Når det gjelder sjeldne tumortyper, brukes en variasjon av denne tilnærmingen kjent som komparativ onkogenomikk på tvers av arter i økende grad for å identifisere nye terapeutiske mål. I komparativ onkogenomikk på tvers av arter utføres genetisk profilering og funksjonell genomikk i genetisk utviklede musmodeller (GEM), og resultatene blir deretter validert i de sjeldne humane prøvene og cellelinjene som er tilgjengelige.

Denne artikkelen beskriver hvordan man identifiserer kandidatdrivergenmutasjoner i MPNST-celler fra mennesker og mus ved bruk av hele eksomsekvensering (WES). Vi beskriver deretter hvordan man utfører genomskala shRNA-skjermer for å identifisere og sammenligne kritiske signalveier i mus og humane MPNST-celler og identifisere medisinerbare mål i disse veiene. Disse metodene gir en effektiv tilnærming til å identifisere nye terapeutiske mål i en rekke humane krefttyper.

Introduction

Ondartede perifere nerveskjede svulster (MPNST) er svært aggressive spindelcellesvulster som oppstår i forbindelse med tumorfølsomhetssyndromet nevrofibromatose type 1 (NF1), sporadisk i den generelle befolkningen og på steder av tidligere strålebehandling ^1,2,3. NF1-pasienter er født med en villtypekopi av NF1-tumorsuppressorgenet og et andre NF1-allel med en funksjonstapsmutasjon. Denne tilstanden av haploinsuffisiens gjør NF1-pasienter utsatt for en andre tap av funksjonsmutasjon i deres villtype NF1-gen, noe som utløser tumorigenese. Når denne “andre hit” NF1-mutasjonen forekommer i en celle i Schwann-cellelinjen, er den resulterende svulsten enten et dermalt nevrofibrom som oppstår i huden eller et plexiform nevrofibrom som utvikler seg i store nerver eller nerveplexuser. Selv om patologien til dermale og pleksiforme nevrofibromer er identiske, er deres biologiske oppførsel ganske annerledes, selv om både dermal og plexiform nevrofibromer er godartede, kan bare pleksiforme nevrofibromer gjennomgå transformasjon og gi opphav til MPNST. I tillegg til tap av nevrofibromin, Ras GTPase-aktiverende protein kodet av NF1-genet, bærer MPNST mutasjoner av flere andre tumorsuppressorgener, inkludert TP53 4,5,6,7, CDKN2A ^8,9 og PTEN 10, mutasjoner av gener som koder for komponenter av polycomb repressivt kompleks 2 ^11,12 (PRC2 ; SUZ12– og EED-gener) og avvikende ekspresjon av reseptortyrosinkinaser ^1,2. Mutasjoner av NF1 og de andre genene nevnt ovenfor er også tilstede i sporadiske og strålingsinduserte MPNST ^11,12.

Selv om disse fremskrittene i vår forståelse av genomiske abnormiteter i MPNST har vært uvurderlige for å forstå deres patogenese, har de ennå ikke resultert i utvikling av effektive nye terapier for MPNST. En stor barriere som hindrer utviklingen av nye behandlinger er det faktum at MPNST er sjeldne kreftformer. På grunn av dette er det vanskelig å få tak i det store antallet pasientprøver som kreves for globale analyser som definerer viktige drivermutasjoner som de som utføres av The Cancer Genome Atlas (TCGA). Vår erfaring er at det kan ta flere år å samle selv et beskjedent antall humane MPNST-prøver. For å overvinne slike begrensninger har mange etterforskere som studerer andre sjeldne krefttyper, vendt seg til bruk av komparativ onkogenomikk på tvers av arter for å identifisere essensielle drivergenmutasjoner, definere de essensielle cytoplasmatiske signalveiene i deres svulst av interesse og identifisere nye terapeutiske mål. Siden signalveiene som er essensielle for tumorigenese er svært konservert mellom mennesker og andre virveldyrarter, kan bruk av funksjonelle genomikktilnærminger som genomskala shRNA-skjermer være et effektivt middel til å identifisere disse nye drivermutasjonene, signalveiene og terapeutiske mål 13,14,15,16,17,18,19, spesielt når man studerer sjeldne humane tumortyper som er tilgjengelige i begrensende antall²⁰.

I metodene som presenteres her, beskriver vi denne tilnærmingen til å utføre genomisk profilering i humane MPNST-cellelinjer og tidlig passasje MPNST-kulturer avledet fra P 0-GGFβ3-mus, en genetisk konstruert musemodell (GEM) der Schwann-cellespesifikk overekspresjon av vekstfaktoren neuregulin-1 (NRG1) fremmer patogenesen av pleksiforme nevrofibromer og deres påfølgende progresjon til MPNST^{21, 22,23}. Det første trinnet i denne tilnærmingen er å identifisere kandidatdrivergener i P 0-GGFβ3 MPNST, humane MPNST-cellelinjer og kirurgisk resekterte humane MPNSTer. For å funksjonelt validere signalveiene som er berørt av disse mutasjonene, bruker vi deretter genomskala shRNA-skjermer for å identifisere genene som kreves for spredning og overlevelse i humane og mus MPNST-cellelinjer. Etter å ha identifisert genene som kreves for spredning og overlevelse, identifiserer vi deretter de medisinerbare genproduktene i samlingen av “treff” ved hjelp av Drug Gene Interaction Database. Vi sammenligner også “treffene” i MPNST-celler fra mennesker og mus for å avgjøre om GEM-modellen og humane MPNST viser lignende avhengighet av de samme genene og signalveiene. Identifisering av overlapping i gener som kreves for spredning og overlevelse og de berørte signalveiene tjener som et middel til å validere P 0-GGFβ3 musemodellen på molekylært nivå. Denne tilnærmingen understreker også effektiviteten av å kombinere menneskelige og museskjermer for å identifisere nye terapeutiske mål, der musemodellen kan tjene som et supplement til de menneskelige skjermene. Verdien av denne kryssartede tilnærmingen er spesielt tydelig når man ser etter terapeutiske mål i sjeldne svulster, hvor humane svulster og cellelinjer er vanskelige å oppnå.

Protocol

Før oppstart av studiene, har dyreprosedyrer og protokoller for håndtering av virale vektorer gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og Institutional Biosafety Committee (IBC). Prosedyrene beskrevet her ble godkjent av Medical University of South Carolina IACUC og IBC Boards og ble utført av riktig opplært personell i samsvar med NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals og MUSCs institusjonelle dyrepleieretningslinjer. 1. WES-Seq-analy…

Representative Results

Figur 5-plott viser uttømmingspoeng av essensielle kjernegener (CEG) merket som SANN sammenlignet med ikke-CEG (merket som FALSE) i hver menneskelig cellelinje som ble screenet. Poeng representerer log2 av foldeuttømmingspoeng for individuelle gener, som er plottet over en boksplottrepresentasjon av den samlede poengfordelingen. Studentens t-test ble brukt til å teste for en signifikant forskjell i gjennomsnittet av uttømmingsscore mellom de to gruppene i hver cellelinje. De res…

Discussion

De detaljerte metodene som presenteres her ble utviklet for å studere perifer nervesystemneoplasi og MPNST-patogenese. Selv om vi har funnet at disse metodene er effektive, bør det erkjennes at det er noen potensielle begrensninger for metodene vi beskriver her. Nedenfor diskuterer vi noen av disse begrensningene og potensielle strategier for å overvinne dem i andre modellsystemer.

Vi har funnet ut at hele eksomsekvensering effektivt identifiserer mutasjoner av interesse i P 0-GGFβ3 mus.<s…

Materials

Bioruptor Sonication System	Diagenode	UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot	Illumina, San Diego, CA	N/A
Celigo Image Cytometer	Nexcelom	N/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve Hybrid	Decon Laboratories	5989-27-5
Corning 96-well Black Microplate	Millipore Sigma	CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes	Diagenode	C30010009
dNTP mix	Clontech	639210
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Elution buffer	Qiagen	19086
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Excel	Microsoft
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’			HPLC purified
GraphPad Prism	Dotmatics
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Illumina HiScanSQ	Illumina, San Diego, CA	N/A
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
PLUS Transfection Reagent	Thermo Scientific	11514015
Polybrene Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR1003G
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Qiagen Buffer P1	Qiagen	19051
Qiagen Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymerase	Clontech	639210
Trimmomatic software		www.usadellab.org