Генетическое профилирование и скрининг отсева на уровне генома для выявления терапевтических мишеней в мышиных моделях злокачественной опухоли оболочки периферических нервов
Summary
Мы разработали межвидовой сравнительный подход к онкогеномике, использующий геномный анализ и функциональный геномный скрининг для выявления и сравнения терапевтических мишеней в опухолях, возникающих на генетически модифицированных мышиных моделях, и соответствующего типа опухоли человека.
Abstract
Злокачественные опухоли оболочки периферических нервов (MPNST) происходят из шванновских клеток или их предшественников. У пациентов с синдромом предрасположенности к опухолям нейрофиброматозом 1 типа (НФ1) МПНТ являются наиболее распространенным злокачественным новообразованием и ведущей причиной смерти. Эти редкие и агрессивные саркомы мягких тканей предлагают суровое будущее, с 5-летней безрецидивной выживаемостью 34-60%. Варианты лечения людей с МПНСТ разочаровывающе ограничены, при этом обезображивающая хирургия является основным вариантом лечения. Многие некогда многообещающие методы лечения, такие как типифарниб, ингибитор передачи сигналов RAS, потерпели клиническую неудачу. Аналогичным образом, клинические испытания II фазы эрлотиниба, который нацелен на эпидермальный фактор роста (EFGR), и сорафениба, который нацелен на рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGF) и Raf, в сочетании со стандартной химиотерапией, также не вызвали ответа у пациентов.
В последние годы методы функционального геномного скрининга в сочетании с генетическим профилированием линий раковых клеток доказали свою полезность для выявления основных цитоплазматических сигнальных путей и разработки таргетно-специфической терапии. В случае редких типов опухолей разновидность этого подхода, известная как межвидовая сравнительная онкогеномика, все чаще используется для выявления новых терапевтических мишеней. В межвидовой сравнительной онкогеномике генетическое профилирование и функциональная геномика выполняются на генетически модифицированных мышиных моделях (GEM), а затем результаты подтверждаются на редких человеческих образцах и клеточных линиях, которые доступны.
В данной статье описывается, как идентифицировать гены-кандидаты-драйверы в клетках MPNST человека и мыши с помощью секвенирования всего экзома (WES). Затем мы опишем, как проводить скрининг шРНК на уровне генома для выявления и сравнения критических сигнальных путей в клетках MPNST мыши и человека и идентификации лекарственных мишеней в этих путях. Эти методологии обеспечивают эффективный подход к выявлению новых терапевтических мишеней при различных типах рака человека.
Introduction
Злокачественные опухоли оболочки периферических нервов (МПНСТ) представляют собой высокоагрессивные веретеноклеточные новообразования, которые возникают в связи с синдромом восприимчивости к опухоли нейрофиброматозом 1 типа (НФ1), спорадически в общей популяции и в местах предшествующей лучевой терапии 1,2,3. Пациенты с НФ1 рождаются с копией гена-супрессора опухолей NF1 дикого типа и вторым аллелем NF1 с мутацией с потерей функции. Это состояние гаплонедостаточности делает пациентов с НФ1 восприимчивыми ко второй мутации с потерей функции в гене НФ1 дикого типа, которая запускает опухолегенез. Когда эта мутация NF1 происходит в клетке шванновской клеточной линии, результирующая опухоль представляет собой либо дермальную нейрофиброму, возникающую в коже, либо плексиформную нейрофиброму, которая развивается в крупных нервах или нервных сплетениях. Несмотря на то, что патология дермальных и плексиформных нейрофибром идентична, их биологическое поведение совершенно различно: хотя и дермальные, и плексиформные нейрофибромы являются доброкачественными, только плексиформные нейрофибромы могут претерпевать трансформацию и давать начало МПНСТ. В дополнение к потере нейрофибромина, белка, активирующего Ras ГТФазу, кодируемого геном NF1, MPNST несут мутации множества других генов-супрессоров опухолей, включая TP53 4,5,6,7, CDKN2A 8,9 и PTEN 10, мутации генов, кодирующих компоненты поликомбного репрессивного комплекса 2 11,12 (PRC2 ; SUZ12 и EED) и аберрантная экспрессия рецепторных тирозинкиназ 1,2. Мутации NF1 и других генов, отмеченных выше, также присутствуют в спорадических и радиационно-индуцированных MPNST11,12.
Несмотря на то, что эти достижения в нашем понимании геномных аномалий у МПНТ были неоценимы для понимания их патогенеза, они еще не привели к разработке новых эффективных методов лечения МПНСТ. Основным препятствием, препятствующим разработке новых методов лечения, является тот факт, что MPNST являются редкими видами рака. Из-за этого трудно получить большое количество образцов пациентов, которые необходимы для глобального анализа, определяющего ключевые мутации, такие как те, которые проводятся Атласом генома рака (TCGA). По нашему опыту, накопление даже небольшого количества человеческих образцов MPNST может занять годы. Чтобы преодолеть эти ограничения, многие исследователи, изучающие другие редкие типы рака, обратились к использованию межвидовой сравнительной онкогеномики для выявления существенных мутаций генов-драйверов, определения основных цитоплазматических сигнальных путей в интересующей их опухоли и определения новых терапевтических мишеней. Поскольку сигнальные пути, необходимые для опухолегенеза, очень консервативны между человеком и другими видами позвоночных, применение подходов функциональной геномики, таких как скрининг шРНК на уровне генома, может быть эффективным средством идентификации этих новых драйверных мутаций, сигнальных путей и терапевтических мишеней 13,14,15,16,17,18,19 , особенно при изучении редких типов опухолей человека, которые доступны в предельных количествах20.
В представленных здесь методологиях мы описываем этот подход к выполнению геномного профилирования в клеточных линиях MPNST человека и культурах раннего пассажа MPNST, полученных от мышей P 0-GGFβ3, генетически модифицированной мышиной модели (GEM), в которой шванновская клеткоспецифическая гиперэкспрессия фактора роста нейрегулина-1 (NRG1) способствует патогенезу плексиформных нейрофибром и их последующей прогрессии до MPNST 21, С. 22,23. Первым шагом в этом подходе является идентификация генов-кандидатов в MPNST P 0-GGFβ3, клеточных линиях MPNST человека и хирургически резецированных MPNST человека. Для функциональной валидации сигнальных путей, затронутых этими мутациями, мы используем скрининг шРНК на уровне генома для идентификации генов, необходимых для пролиферации и выживания в клеточных линиях MPNST человека и мыши. После идентификации генов, необходимых для пролиферации и выживания, мы определяем лекарственные генные продукты в коллекции «хитов» с помощью базы данных по взаимодействию генов с лекарственными препаратами. Мы также сравниваем «попадания» в клетки человека и мыши MPNST, чтобы определить, демонстрируют ли модель GEM и MPNST человека одинаковую зависимость от одних и тех же генов и сигнальных путей. Идентификация перекрытий в генах, необходимых для пролиферации и выживания, а также в затронутых сигнальных путях служит средством валидации мышиной модели P 0-GGFβ3 на молекулярном уровне. Этот подход также подчеркивает эффективность комбинирования скринингов человека и мыши для выявления новых терапевтических мишеней, где мышиная модель может служить дополнением к человеческим экранам. Ценность этого межвидового подхода особенно очевидна при поиске терапевтических мишеней в редких опухолях, где трудно получить человеческие опухоли и клеточные линии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Детально представленные методы были разработаны для изучения неоплазии периферической нервной системы и патогенеза МПНСТ. Несмотря на то, что мы считаем эти методы эффективными, следует признать, что существуют некоторые потенциальные ограничения для методов, которые мы здесь описыв…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Национального института неврологических заболеваний и инсульта (R01 NS048353 и R01 NS109655 S.L.C.; R01 NS109655-03S1 в D.P.J.), Национальный институт рака (R01 CA122804 в S.L.C.) и Министерство обороны (X81XWH-09-1-0086 и W81XWH-12-1-0164 в S.L.C.).
Materials
| Bioruptor Sonication System | Diagenode | UCD-600 | |
| CASAVA 1.8.2 | |||
| Cbot | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software | |||
| Citrisolve Hybrid | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Corning 96-well Black Microplate | Millipore Sigma | CLS3603 | |
| Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes | Diagenode | C30010009 | |
| dNTP mix | Clontech | 639210 | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Elution buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’ | |||
| FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’ | |||
| GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’ | HPLC purified | ||
| GraphPad Prism | Dotmatics | ||
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Illumina HiScanSQ | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| PLUS Transfection Reagent | Thermo Scientific | 11514015 | |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR1003G | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Qiagen Buffer P1 | Qiagen | 19051 | |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’ | |||
| RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’ | |||
| Titanium Taq polymerase | Clontech | 639210 | |
| Trimmomatic software | www.usadellab.org |
References
- Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).
- Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent Advances in the Diagnosis and Pathogenesis of Neurofibromatosis Type 1 (NF1)-associated Peripheral Nervous System Neoplasms. Adv Anat Pathol. 25 (5), 353-368 (2018).
- Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Adv Cancer Res. 153, 305-341 (2022).
- Birindelli, S., et al. Rb and TP53 pathway alterations in sporadic and NF1-related malignant peripheral nerve sheath tumors. Lab Invest. 81 (6), 833-844 (2001).
- Legius, E., et al. TP53 mutations are frequent in malignant NF1 tumors. Genes Chromosomes Cancer. 10 (4), 250-255 (1994).
- Menon, A. G., et al. Chromosome 17p deletions and p53 gene mutations associated with the formation of malignant neurofibrosarcomas in von Recklinghausen neurofibromatosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (14), 5435-5439 (1990).
- Upadhyaya, M., et al. Germline and somatic NF1 gene mutation spectrum in NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs). Hum Mutat. 29 (1), 74-82 (2008).
- Kourea, H. P., Orlow, I., Scheithauer, B. W., Cordon-Cardo, C., Woodruff, J. M. Deletions of the INK4A gene occur in malignant peripheral nerve sheath tumors but not in neurofibromas. Am J Pathol. 155 (6), 1855-1860 (1999).
- Nielsen, G. P., et al. Malignant transformation of neurofibromas in neurofibromatosis 1 is associated with CDKN2A/p16 inactivation. Am J Pathol. 155 (6), 1879-1884 (1999).
- Gregorian, C., et al. PTEN dosage is essential for neurofibroma development and malignant transformation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (46), 19479-19484 (2009).
- Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1227-1232 (2014).
- Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1170-1172 (2014).
- Varela, I., et al. Somatic structural rearrangements in genetically engineered mouse mammary tumors. Genome Biol. 11 (10), 100 (2010).
- Johnson, R. A., et al. Cross-species genomics matches driver mutations and cell compartments to model ependymoma. Nature. 466 (7306), 632-636 (2010).
- Kim, M., et al. Comparative oncogenomics identifies NEDD9 as a melanoma metastasis gene. Cell. 125 (7), 1269-1281 (2006).
- Zender, L., et al. Identification and validation of oncogenes in liver cancer using an integrative oncogenomic approach. Cell. 125 (7), 1253-1267 (2006).
- Uren, A. G., et al. Large-scale mutagenesis in p19(ARF)- and p53-deficient mice identifies cancer genes and their collaborative networks. Cell. 133 (4), 727-741 (2008).
- Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323 (5922), 1747-1750 (2009).
- Dupuy, A. J., et al. A modified sleeping beauty transposon system that can be used to model a wide variety of human cancers in mice. Cancer Res. 69 (20), 8150-8156 (2009).
- Carroll, S. L. The Challenge of Cancer Genomics in Rare Nervous System Neoplasms: Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors as a Paradigm for Cross-Species Comparative Oncogenomics. Am J Pathol. 186 (3), 464-477 (2016).
- Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. J Neurosci. 23 (19), 7269-7280 (2003).
- Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. Am J Pathol. 182 (3), 646-667 (2013).
- Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathol. 127 (4), 573-591 (2014).
- Hart, T., Brown, K. R., Sircoulomb, F., Rottapel, R., Moffat, J. Measuring error rates in genomic perturbation screens: gold standards for human functional genomics. Mol Syst Biol. 10 (7), 733 (2014).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens. G3. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Sci Rep. 11 (1), 5690 (2021).
- Maser, R. S., et al. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447 (7147), 966-971 (2007).
- Rahrmann, E. P., et al. Forward genetic screen for malignant peripheral nerve sheath tumor formation identifies new genes and pathways driving tumorigenesis. Nat Genet. 45 (7), 756-766 (2013).
