Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümörünün Fare Modellerinde Terapötik Hedefleri Belirlemek için Genetik Profilleme ve Genom Ölçeğinde Bırakma Taraması
Summary
Genetiği değiştirilmiş fare modellerinde ortaya çıkan tümörlerde terapötik hedefleri ve karşılık gelen insan tümör tipini belirlemek ve karşılaştırmak için genomik analizler ve fonksiyonel genomik ekranlar kullanan türler arası karşılaştırmalı bir onkogenomik yaklaşım geliştirdik.
Abstract
Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümörleri (MPNST’ler) Schwann hücrelerinden veya öncüllerinden türetilir. Tümör yatkınlık sendromu nörofibromatozis tip 1 (NF1) olan hastalarda, MPNST’ler en sık görülen malignite ve önde gelen ölüm nedenidir. Bu nadir ve agresif yumuşak doku sarkomları, 5 yıllık hastalıksız sağkalım oranlarının %34-60 olduğu keskin bir gelecek sunmaktadır. MPNST’li bireyler için tedavi seçenekleri hayal kırıklığı yaratacak şekilde sınırlıdır ve şekil bozucu cerrahi en önde gelen tedavi seçeneğidir. Ras sinyalinin bir inhibitörü olan tipifarnib gibi bir zamanlar umut vaat eden birçok tedavi klinik olarak başarısız olmuştur. Benzer şekilde, epidermal büyüme faktörünü (EFGR) hedefleyen erlotinib ve vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörünü (VEGF), trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörünü (PDGF) ve Raf’ı hedefleyen sorafenib ile yapılan faz II klinik çalışmalar da standart kemoterapi ile kombinasyon halinde hastalarda yanıt üretememiştir.
Son yıllarda, kanser hücre hatlarının genetik profillemesi ile birleştirilen fonksiyonel genomik tarama yöntemlerinin, temel sitoplazmik sinyal yolaklarının tanımlanması ve hedefe özgü tedavilerin geliştirilmesi için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Nadir tümör tipleri söz konusu olduğunda, türler arası karşılaştırmalı onkogenomik olarak bilinen bu yaklaşımın bir varyasyonu, yeni terapötik hedefleri belirlemek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Türler arası karşılaştırmalı onkogenomikte, genetik olarak tasarlanmış fare (GEM) modellerinde genetik profilleme ve fonksiyonel genomik gerçekleştirilir ve sonuçlar daha sonra mevcut olan nadir insan örneklerinde ve hücre hatlarında doğrulanır.
Bu makale, tüm ekzom dizileme (WES) kullanılarak insan ve fare MPNST hücrelerinde aday sürücü gen mutasyonlarının nasıl tanımlanacağını açıklamaktadır. Daha sonra, fare ve insan MPNST hücrelerindeki kritik sinyal yollarını tanımlamak ve karşılaştırmak ve bu yollardaki ilaçlanabilir hedefleri belirlemek için genom ölçeğinde shRNA taramalarının nasıl gerçekleştirileceğini açıklıyoruz. Bu metodolojiler, çeşitli insan kanseri türlerinde yeni terapötik hedeflerin belirlenmesinde etkili bir yaklaşım sağlar.
Introduction
Malign periferik sinir kılıfı tümörleri (MPNST’ler), tümör yatkınlık sendromu nörofibromatozis tip 1 (NF1) ile birlikte, sporadik olarak genel popülasyonda ve önceki radyoterapi bölgelerindeortaya çıkan oldukça agresif iğsi hücreli neoplazmlardır 1,2,3. NF1 hastaları, NF1 tümör baskılayıcı geninin vahşi tip bir kopyası ve fonksiyon kaybı mutasyonu olan ikinci bir NF1 aleli ile doğarlar. Bu haplo yetmezliği durumu, NF1 hastalarını, tümör oluşumunu tetikleyen vahşi tip NF1 genlerinde ikinci bir fonksiyon kaybı mutasyonuna duyarlı hale getirir. Bu “ikinci vuruş” NF1 mutasyonu Schwann hücre soyundaki bir hücrede meydana geldiğinde, ortaya çıkan tümör ya deride ortaya çıkan bir dermal nörofibrom ya da büyük sinirlerde veya sinir pleksuslarında gelişen bir pleksiform nörofibromdur. Dermal ve pleksiform nörofibromların patolojisi aynı olmasına rağmen, biyolojik davranışları oldukça farklıdır – hem dermal hem de pleksiform nörofibromlar iyi huylu olmasına rağmen, sadece pleksiform nörofibromlar dönüşüme uğrayabilir ve MPNST’lere yol açabilir. NF1 geni tarafından kodlanan Ras GTPaz aktive edici protein olan nörofibromin kaybına ek olarak, MPNST’ler, TP53 4,5,6,7, CDKN2A 8,9 ve PTEN 10 dahil olmak üzere diğer birçok tümör baskılayıcı genin mutasyonlarını taşır, policomb baskılayıcı kompleks 2 11,12 (PRC2 ; SUZ12 ve EED genleri) ve reseptör tirozin kinazların anormal ekspresyonu 1,2. NF1 ve yukarıda belirtilen diğer genlerin mutasyonları, sporadik ve radyasyona bağlı MPNST’lerdede mevcuttur 11,12.
MPNST’lerdeki genomik anormallikleri anlamamızdaki bu ilerlemeler, patogenezlerini anlamak için paha biçilmez olsa da, henüz MPNST’ler için etkili yeni tedavilerin geliştirilmesine yol açmamıştır. Yeni tedavilerin geliştirilmesini engelleyen önemli bir engel, MPNST’lerin nadir görülen kanserler olduğu gerçeğidir. Bu nedenle, Kanser Genom Atlası (TCGA) tarafından üstlenilenler gibi temel itici mutasyonları tanımlayan küresel analizler için gerekli olan çok sayıda hasta örneğini elde etmek zordur. Deneyimlerimize göre, mütevazı sayıda insan MPNST örneğinin bile biriktirilmesi yıllar alabilir. Bu tür sınırlamaların üstesinden gelmek için, diğer nadir kanser türlerini inceleyen birçok araştırmacı, temel sürücü gen mutasyonlarını tanımlamak, ilgilendikleri tümördeki temel sitoplazmik sinyal yollarını tanımlamak ve yeni terapötik hedefleri belirlemek için türler arası karşılaştırmalı onkogenomik kullanımına yönelmiştir. Tümör oluşumu için gerekli olan sinyal yolları, insanlar ve diğer omurgalı türleri arasında yüksek oranda korunduğundan, genom ölçekli shRNA ekranları gibi fonksiyonel genomik yaklaşımların uygulanması, bu yeni sürücü mutasyonları, sinyal yollarını ve terapötik hedefleri tanımlamanın etkili bir yolu olabilir 13,14,15,16,17,18,19, özellikle sınırlı sayıda mevcut olan nadir insan tümör tiplerini incelerken20.
Burada sunulan metodolojilerde, Schwann hücresine özgü büyüme faktörü nöregulin-1’in (NRG1) aşırı ekspresyonunun pleksiform nörofibromların patogenezini ve daha sonra MPNST’lere ilerlemesini teşvik ettiği genetik olarak tasarlanmış bir fare modeli (GEM) olan P 0-GGFβ3 farelerinden türetilen insan MPNST hücre hatlarında ve erken geçiş MPNST kültürlerinde genomik profilleme gerçekleştirmeye yönelik bu yaklaşımı açıklıyoruz 21, 22,23. Bu yaklaşımdaki ilk adım, P 0-GGFβ3 MPNST’lerde, insan MPNST hücre hatlarında ve cerrahi olarak rezeke edilen insan MPNST’lerinde aday sürücü genlerini tanımlamaktır. Bu mutasyonlardan etkilenen sinyal yollarını işlevsel olarak doğrulamak için, insan ve fare MPNST hücre hatlarında proliferasyon ve hayatta kalma için gerekli genleri tanımlamak için genom ölçeğinde shRNA ekranları kullanıyoruz. Proliferasyon ve hayatta kalma için gerekli genleri belirledikten sonra, İlaç Gen Etkileşimi Veritabanını kullanarak “hit” koleksiyonundaki ilaçlanabilir gen ürünlerini tanımlarız. Ayrıca, GEM modelinin ve insan MPNST’lerinin aynı genlere ve sinyal yollarına benzer bağımlılık gösterip göstermediğini belirlemek için insan ve fare MPNST hücrelerindeki “isabetleri” karşılaştırıyoruz. Proliferasyon ve hayatta kalma için gerekli genlerdeki örtüşmelerin ve etkilenen sinyal yolaklarının belirlenmesi, P 0-GGFβ3 fare modelini moleküler düzeyde doğrulamanın bir yolu olarak hizmet eder. Bu yaklaşım aynı zamanda, fare modelinin insan ekranlarının tamamlayıcısı olarak hizmet edebileceği yeni terapötik hedefleri belirlemek için insan ve fare ekranlarını birleştirmenin etkinliğini vurgulamaktadır. Bu türler arası yaklaşımın değeri, insan tümörlerinin ve hücre hatlarının elde edilmesinin zor olduğu nadir tümörlerde terapötik hedefler ararken özellikle belirgindir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan ayrıntılı yöntemler periferik sinir sistemi neoplazisi ve MPNST patogenezini incelemek için geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin etkili olduğunu bulmuş olsak da, burada tanımladığımız yöntemlerin bazı potansiyel sınırlamaları olduğu kabul edilmelidir. Aşağıda, bu sınırlamalardan bazılarını ve diğer model sistemlerde bunların üstesinden gelmek için potansiyel stratejileri tartışıyoruz.
Tüm ekzom diziliminin, P 0-GGFβ3 farelerinde ilgilenilen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü’nden (R01 NS048353 ve R01 NS109655 SLC’ye hibelerle desteklenmiştir; R01 NS109655-03S1’den D.P.J.’ye), Ulusal Kanser Enstitüsü (R01 CA122804’den SLC’ye) ve Savunma Bakanlığı (X81XWH-09-1-0086 ve W81XWH-12-1-0164’ten SLC’ye).
Materials
| Bioruptor Sonication System | Diagenode | UCD-600 | |
| CASAVA 1.8.2 | |||
| Cbot | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software | |||
| Citrisolve Hybrid | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Corning 96-well Black Microplate | Millipore Sigma | CLS3603 | |
| Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes | Diagenode | C30010009 | |
| dNTP mix | Clontech | 639210 | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Elution buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’ | |||
| FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’ | |||
| GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’ | HPLC purified | ||
| GraphPad Prism | Dotmatics | ||
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Illumina HiScanSQ | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| PLUS Transfection Reagent | Thermo Scientific | 11514015 | |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR1003G | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Qiagen Buffer P1 | Qiagen | 19051 | |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’ | |||
| RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’ | |||
| Titanium Taq polymerase | Clontech | 639210 | |
| Trimmomatic software | www.usadellab.org |
References
- Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).
- Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent Advances in the Diagnosis and Pathogenesis of Neurofibromatosis Type 1 (NF1)-associated Peripheral Nervous System Neoplasms. Adv Anat Pathol. 25 (5), 353-368 (2018).
- Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Adv Cancer Res. 153, 305-341 (2022).
- Birindelli, S., et al. Rb and TP53 pathway alterations in sporadic and NF1-related malignant peripheral nerve sheath tumors. Lab Invest. 81 (6), 833-844 (2001).
- Legius, E., et al. TP53 mutations are frequent in malignant NF1 tumors. Genes Chromosomes Cancer. 10 (4), 250-255 (1994).
- Menon, A. G., et al. Chromosome 17p deletions and p53 gene mutations associated with the formation of malignant neurofibrosarcomas in von Recklinghausen neurofibromatosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (14), 5435-5439 (1990).
- Upadhyaya, M., et al. Germline and somatic NF1 gene mutation spectrum in NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs). Hum Mutat. 29 (1), 74-82 (2008).
- Kourea, H. P., Orlow, I., Scheithauer, B. W., Cordon-Cardo, C., Woodruff, J. M. Deletions of the INK4A gene occur in malignant peripheral nerve sheath tumors but not in neurofibromas. Am J Pathol. 155 (6), 1855-1860 (1999).
- Nielsen, G. P., et al. Malignant transformation of neurofibromas in neurofibromatosis 1 is associated with CDKN2A/p16 inactivation. Am J Pathol. 155 (6), 1879-1884 (1999).
- Gregorian, C., et al. PTEN dosage is essential for neurofibroma development and malignant transformation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (46), 19479-19484 (2009).
- Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1227-1232 (2014).
- Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1170-1172 (2014).
- Varela, I., et al. Somatic structural rearrangements in genetically engineered mouse mammary tumors. Genome Biol. 11 (10), 100 (2010).
- Johnson, R. A., et al. Cross-species genomics matches driver mutations and cell compartments to model ependymoma. Nature. 466 (7306), 632-636 (2010).
- Kim, M., et al. Comparative oncogenomics identifies NEDD9 as a melanoma metastasis gene. Cell. 125 (7), 1269-1281 (2006).
- Zender, L., et al. Identification and validation of oncogenes in liver cancer using an integrative oncogenomic approach. Cell. 125 (7), 1253-1267 (2006).
- Uren, A. G., et al. Large-scale mutagenesis in p19(ARF)- and p53-deficient mice identifies cancer genes and their collaborative networks. Cell. 133 (4), 727-741 (2008).
- Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323 (5922), 1747-1750 (2009).
- Dupuy, A. J., et al. A modified sleeping beauty transposon system that can be used to model a wide variety of human cancers in mice. Cancer Res. 69 (20), 8150-8156 (2009).
- Carroll, S. L. The Challenge of Cancer Genomics in Rare Nervous System Neoplasms: Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors as a Paradigm for Cross-Species Comparative Oncogenomics. Am J Pathol. 186 (3), 464-477 (2016).
- Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. J Neurosci. 23 (19), 7269-7280 (2003).
- Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. Am J Pathol. 182 (3), 646-667 (2013).
- Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathol. 127 (4), 573-591 (2014).
- Hart, T., Brown, K. R., Sircoulomb, F., Rottapel, R., Moffat, J. Measuring error rates in genomic perturbation screens: gold standards for human functional genomics. Mol Syst Biol. 10 (7), 733 (2014).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens. G3. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Sci Rep. 11 (1), 5690 (2021).
- Maser, R. S., et al. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447 (7147), 966-971 (2007).
- Rahrmann, E. P., et al. Forward genetic screen for malignant peripheral nerve sheath tumor formation identifies new genes and pathways driving tumorigenesis. Nat Genet. 45 (7), 756-766 (2013).
