Ufraktioneret bulkkultur af museskeletmuskulatur for at rekapitulere niche- og stamcellestilstand
Summary
Skeletmuskulatur omfatter flere celletyper, herunder residente stamceller, hver med et særligt bidrag til muskelhomeostase og regenerering. Her beskrives 2D-kulturen af muskelstamceller og muskelcellenichen i en ex vivo-indstilling, der bevarer mange af de fysiologiske, in vivo og miljømæssige egenskaber.
Abstract
Skeletmuskulatur er kroppens største væv og udfører flere funktioner, fra bevægelse til kropstemperaturkontrol. Dens funktionalitet og genopretning fra skader afhænger af en lang række celletyper og af molekylære signaler mellem kernemuskelcellerne (myofibre, muskelstamceller) og deres niche. De fleste eksperimentelle indstillinger bevarer ikke dette komplekse fysiologiske mikromiljø, og de tillader heller ikke ex vivo-undersøgelse af muskelstamceller i hvile, en celletilstand, der er afgørende for dem. Her skitseres en protokol for ex vivo-kulturen af muskelstamceller med cellulære komponenter i deres niche. Gennem mekanisk og enzymatisk nedbrydning af muskler opnås en blanding af celletyper, som sættes i 2D-kultur. Immunfarvning viser, at inden for 1 uge er flere nicheceller til stede i kultur sammen med myofibre og vigtigere Pax7-positive celler, der viser egenskaberne ved hvilende muskelstamceller. Disse unikke egenskaber gør denne protokol til et kraftfuldt værktøj til celleforstærkning og generering af hvilende-lignende stamceller, der kan bruges til at løse grundlæggende og translationelle spørgsmål.
Introduction
Bevægelse, vejrtrækning, stofskifte, kropsholdning og vedligeholdelse af kropstemperatur afhænger alle af skeletmuskulatur, og funktionsfejl i skeletmuskulaturen kan således forårsage svækkende patologier (dvs. myopatier, muskeldystrofier osv.) 1. I betragtning af dets væsentlige funktioner og overflod har skeletmuskulatur henledt opmærksomheden fra forskningslaboratorier over hele verden, der stræber efter at forstå de vigtigste aspekter, der understøtter normal muskelfunktion og kan tjene som terapeutiske mål. Derudover er skeletmuskulatur en meget anvendt model til at studere regenerering og stamcellefunktion, da sund muskel fuldt ud kan reparere sig selv efter fuldstændig skade og degeneration, hovedsagelig på grund af dens hjemmehørende stamceller2; Disse kaldes også satellitceller og er lokaliseret under basal lamina i periferien af muskelfibrene3.
Kernecellerne i voksen skeletmuskulatur er myofibrene (lange syncytiale multinukleære celler) og satellitcellerne (stamceller med myogent potentiale, der er hvilende, indtil en skade aktiverer dem). Sidstnævnte celler er de centrale celler i muskelregenerering, og denne proces kan ikke forekomme i deres fravær 4,5,6,7. I deres umiddelbare mikromiljø er der flere celletyper og molekylære faktorer, der signalerer til dem. Denne niche etableres gradvist gennem udvikling og indtil voksenalderen8. Voksen muskel indeholder flere celletyper (endotelceller, pericytter, makrofager, fibro-adipogene stamceller-FAP’er, regulatoriske T-celler osv.) 9,10 og ekstracellulære matrixkomponenter (lamininer, kollagener, fibronectin, fibrilliner, periostin osv.) 11, der interagerer med hinanden og med satellitcellerne i forbindelse med sundhed, sygdom og regenerering.
Bevarelse af denne komplekse niche i eksperimentelle indstillinger er grundlæggende, men udfordrende. Lige så vanskeligt er det at opretholde eller vende tilbage til hvile, en celletilstand, der er kritisk for satellitceller9. Der er indført flere metoder til delvist at tackle disse udfordringer, hver med sine fordele og ulemper (detaljeret i diskussionsafsnittet). Her præsenteres en metode, der delvist kan overvinde disse to barrierer. Muskler høstes først og nedbrydes derefter mekanisk og enzymatisk, før den heterogene celleblanding sættes i kultur. I løbet af kulturen detekteres mange celletyper af nichen, og satellitceller, der er vendt tilbage til hvile, observeres. Som et sidste trin i protokollen præsenteres immunofluorescenstrinnene, der muliggør påvisning af hver celletype ved brug af universelt accepterede markører.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voksen skeletmuskelfunktion understøttes af et fint orkestreret sæt cellulære interaktioner og molekylære signaler. Her præsenteres en metode, der giver mulighed for undersøgelse af disse parametre i en ex vivo-indstilling , der ligner det fysiologiske mikromiljø.
Flere grupper har rapporteret in vitro metoder til dyrkning af myogene celler. Disse metoder havde til formål at isolere satellitceller for at studere deres myogene stamfaderegenskaber. To hovedmetoder anven…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Til figur 2 blev der brugt skabeloner fra Servier Medical Art (https://smart.servier.com/). FR-laboratoriet støttes af Association Française contre les Myopathies – AFM via TRANSLAMUSCLE (tilskud 19507 og 22946), Fondation pour la Recherche Médicale – FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), Agence Nationale pour la Recherche – ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) og La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130). Ovennævnte bidragydere havde ingen rolle i udformningen, indsamlingen, analysen, fortolkningen eller rapporteringen af denne undersøgelse eller skrivningen af dette manuskript.
Materials
| anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
| anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
| anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
| anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
| anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
| anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
| anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
| anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
| anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
| bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
| BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
| cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
| cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
| cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
| Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
| Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
| Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
| Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
| Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
| Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
| Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
| Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Forcina, L., Cosentino, M., Musarò, A. Mechanisms regulating muscle regeneration: Insights into the interrelated and time-dependent phases of tissue healing. Cells. 9 (5), 1297 (2020).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- McCarthy, J. J., et al. Effective fiber hypertrophy in satellite cell-depleted skeletal muscle. Development. 138 (17), 3657-3666 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Hicks, M. R., Pyle, A. D. The emergence of the stem cell niche. Trends in Cell Biology. 33 (22), 112-123 (2022).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Gama, J. F. G., et al. Role of regulatory T cells in skeletal muscle regeneration: A systematic review. Biomolecules. 12 (6), 817 (2022).
- Loreti, M., Sacco, A. The jam session between muscle stem cells and the extracellular matrix in the tissue microenvironment. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 16 (2022).
- Sambasivan, R., et al. Distinct regulatory cascades govern extraocular and pharyngeal arch muscle progenitor cell fates. Developmental Cell. 16 (6), 810-821 (2009).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Bismuth, K., Relaix, F. Genetic regulation of skeletal muscle development. Experimental Cell Research. 316 (18), 3081-3086 (2010).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: From the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Abou-Khalil, R., Le Grand, F., Chazaud, B. Human and murine skeletal muscle reserve cells. Stem Cell Niche. 1035, 165-177 (2013).
- Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2011).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Qu, Y., Edwards, K., Barrow, J. Isolation, culture, and use of primary murine myoblasts in small-molecule screens. STAR Protocols. 4 (2), 102149 (2023).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: Background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2011).
- Saclier, M., Theret, M., Mounier, R., Chazaud, B. Effects of macrophage conditioned-medium on murine and human muscle cells: analysis of proliferation, differentiation, and fusion. Methods in Molecular Biology. 1556, 317-327 (2017).
- Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Molecular Cell. 74 (3), 609-621 (2019).
- Tabula Muris Consortium et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Brunetti, J., Koenig, S., Monnier, A., Frieden, M. Nanopattern surface improves cultured human myotube maturation. Skeletal Muscle. 11 (1), 12 (2021).
- Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).
- LaFramboise, W. A., et al. Effect of muscle origin and phenotype on satellite cell muscle-specific gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (10), 1307-1318 (2003).
- Azhar, M., Wardhani, B. W. K., Renesteen, E. The regenerative potential of Pax3/Pax7 on skeletal muscle injury. Journal of Generic Engineering and Biotechnology. 20 (1), 143 (2022).
- Hardy, D., et al. Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
