Reazione a catena della polimerasi e ibridazione dot-blot per la rilevazione di leptospira in campioni d'acqua

Summary

In questo studio, è stata progettata un’applicazione di dot-blot per rilevare Leptospira dai tre cladi principali nei campioni d’acqua. Questo metodo consente l’identificazione di quantità minime di DNA specificamente bersaglio di una sonda marcata con digossigenina, facilmente rilevabili da un anticorpo anti-digossigenina. Questo approccio è uno strumento prezioso e soddisfacente ai fini dello screening.

Abstract

Il dot-blot è una tecnica semplice, veloce, sensibile e versatile che consente l’identificazione di quantità minime di DNA specificamente bersaglio dell’ibridazione della sonda in presenza di DNA vettore. Si basa sul trasferimento di una quantità nota di DNA su un supporto solido inerte, come una membrana di nylon, utilizzando l’apparato dot-blot e senza separazione elettroforetica. Le membrane in nylon hanno il vantaggio di un’elevata capacità di legame dell’acido nucleico (400 μg/cm²), un’elevata resistenza e sono caricate positivamente o neutramente. La sonda utilizzata è un frammento di ssDNA altamente specifico di 18-20 basi lunghe marcate con digossigenina (DIG). La sonda si coniugherà con il DNA di Leptospira . Una volta che la sonda si è ibridata con il DNA bersaglio, viene rilevata da un anticorpo anti-digossigenina, consentendone una facile rilevazione attraverso le sue emissioni rivelate in una pellicola radiografica. I punti con un’emissione corrisponderanno ai frammenti di DNA di interesse. Questo metodo impiega la marcatura non isotopica della sonda, che può avere un’emivita molto lunga. Lo svantaggio di questa immuno-marcatura standard è una sensibilità inferiore rispetto alle sonde isotopiche. Tuttavia, è mitigato dall’accoppiamento della reazione a catena della polimerasi (PCR) e dai saggi dot-blot. Questo approccio consente l’arricchimento della sequenza di destinazione e il relativo rilevamento. Inoltre, può essere utilizzato come applicazione quantitativa se confrontato con una diluizione seriale di uno standard noto. Qui viene presentata un’applicazione dot-blot per rilevare Leptospira dai tre cladi principali nei campioni d’acqua. Questa metodologia può essere applicata a grandi quantità di acqua una volta che sono state concentrate mediante centrifugazione per fornire prove della presenza di DNA leptospirale. Questo è uno strumento prezioso e soddisfacente per scopi di screening generali e può essere utilizzato per altri batteri non coltivabili che possono essere presenti nell’acqua, migliorando la comprensione dell’ecosistema.

Introduction

La leptospirosi nell’uomo ha origine principalmente da fonti ambientali ^1,2. La presenza di Leptospira in laghi, fiumi e torrenti è un indicatore della trasmissione della leptospirosi tra la fauna selvatica e gli animali domestici e da produzione che possono eventualmente entrare in contatto con questi corpi idrici ^1,3,4. Inoltre, Leptospira è stata identificata in fonti non naturali, tra cui acque reflue, stagnanti e di rubinetto ^5,6.

Leptospira è un batterio distribuito in tutto il mondo ^7,8 e il ruolo dell’ambiente nella sua conservazione e trasmissione è stato ben riconosciuto. La Leptospira può sopravvivere nell’acqua potabile a pH e minerali variabili⁹ e nei corpi idrici naturali¹. Può anche sopravvivere per lunghi periodi in acqua distillata¹⁰ e, a pH costante (7,8), può sopravvivere fino a 152 giorni¹¹. Inoltre, Leptospira può interagire in consorzi batterici per sopravvivere a condizioni difficili^12,13. Può far parte di biofilm in acqua dolce con Azospirillum e Sphingomonas ed è anche in grado di crescere e sopportare temperature superiori a 49 °C^14,15. Può anche moltiplicarsi in terreni impregnati d’acqua e rimanere vitale fino a 379 giorni¹⁶, preservando la sua capacità di causare la malattia fino a un anno^17,18. Tuttavia, si sa poco sull’ecologia all’interno dei corpi idrici e su come è distribuita al loro interno.

Fin dalla sua scoperta, lo studio del genere Leptospira si è basato su test sierologici. Non è stato fino al secolo in corso che le tecniche molecolari sono diventate più diffuse nello studio di questa spirocheta. Il dot-blot è stato scarsamente utilizzato per la sua identificazione utilizzando (1) una sonda isotopica basata sull’rRNA 16S e su una ripetizione di sequenza intersemplice (ISSR)^19,20, (2) come test immunologico basato su nanogold per la leptospirosi umana applicata all’urina²¹, o (3) come test basato su anticorpi per campioni di urina bovina²². La tecnica cadde in disuso perché originariamente si basava su sonde isotopiche. Tuttavia, è una tecnica ben nota che, abbinata alla PCR, produce risultati migliori ed è considerata sicura grazie all’uso di sonde non isotopiche. La PCR svolge un ruolo cruciale nell’arricchimento del DNA di Leptospira amplificando uno specifico frammento di DNA che può essere trovato in tracce in un campione. Durante ogni ciclo di PCR, la quantità del frammento di DNA bersaglio viene raddoppiata nella reazione. Alla fine della reazione, l’amplicone è stato moltiplicato per un fattore di oltre un milione²³. Il prodotto amplificato mediante PCR, spesso non visibile nell’elettroforesi dell’agarosio, diventa visibile attraverso un’ibridazione specifica con una sonda marcata con DIG nel dot-blot 24,25,26.

La tecnica del dot-blot è semplice, robusta e adatta a numerosi campioni, rendendola accessibile ai laboratori con risorse limitate. È stato impiegato in una varietà di studi sui batteri, tra cui (1) batteri orali²⁷, (2) altri tipi di campioni come cibo e feci²⁸ e (3) l’identificazione di batteri non coltivabili²⁹, spesso in accordo con altre tecniche molecolari. Tra i vantaggi offerti dalla tecnica del dot-blot ci sono: (1) La membrana ha un’elevata capacità legante, in grado di legare oltre 200 μg/^cm2 di acidi nucleici e fino a 400 μg/^cm2; (2) I risultati del dot-blot possono essere interpretati visivamente senza richiedere attrezzature speciali e (3) possono essere comodamente conservati per anni a temperatura ambiente (RT).

Il genere Leptospira è stato classificato in cladi patogeni, intermedi e saprofiti^30,31. La distinzione tra questi cladi può essere ottenuta in base a geni specifici come lipL41, lipL32 e l’rRNA 16S. LipL32 è presente nei cladi patogeni e mostra un’elevata sensibilità in vari strumenti sierologici e molecolari, mentre è assente nelle specie di saprofiti²¹. Il gene housekeeping lipL41 è noto per la sua espressione stabile e utilizzato nelle tecniche molecolari³², mentre il gene 16S rRNA è utilizzato per la loro classificazione.

Questa metodologia può essere applicata a grandi volumi d’acqua una volta che sono stati concentrati per centrifugazione. Consente la valutazione di vari punti e profondità all’interno di un corpo idrico per rilevare la presenza di DNA leptospirale e del clade a cui appartiene. Questo strumento è prezioso sia per scopi ecologici che di screening generale e può essere utilizzato anche per rilevare altri batteri non coltivabili che possono essere presenti nell’acqua.

Inoltre, i test PCR e dot-blot sono tecnicamente ed economicamente accessibili a un’ampia gamma di laboratori, anche a quelli privi di attrezzature sofisticate o costose. Questo studio mira ad applicare il dot-blot a base di digoxigenina per l’identificazione dei tre cladi di Leptospira in campioni d’acqua raccolti da corpi idrici naturali.

Ceppi batterici
In questo studio sono stati inclusi dodici sierotipi di Leptospira (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi e Wolffi). Questi sierotipi fanno parte della collezione del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, Facoltà di Medicina Veterinaria e Zootecnica, Università Nazionale Autonoma del Messico, e sono attualmente utilizzati nel test di microagglutinazione (MAT).

Tutti i sierotipi di Leptospira sono stati coltivati in EMJH e il loro DNA è stato estratto utilizzando un kit commerciale per l’estrazione del DNA (vedi Tabella dei materiali). Una miscela di DNA genomico dei dodici sierotipi è stata utilizzata come controllo positivo per il clade patogeno Leptospira . Come controllo positivo del clade intermedio di Leptospira , è stato incluso il DNA genomico del ceppo BUT6 del sierotipo Hurstbridge di Leptospira fainei e, come controllo positivo per il clade saprofita di Leptospira , è stato incluso anche il DNA genomico del ceppo Patoc Patoc I.

I controlli negativi consistevano in un plasmide vuoto, DNA di batteri non imparentati (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii ed Escherichia coli) e acqua di grado PCR, che fungeva da controllo non stampo.

Campioni d’acqua
Dodici campioni di prova sono stati raccolti utilizzando un metodo di campionamento stratificato e casuale dal Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19° 16′ 54″ N 99° 6′ 11″ W). Questi campioni sono stati ottenuti a tre profondità: superficiale, 10 e 30 cm (Figura 1A, B). Le procedure di raccolta dell’acqua non hanno avuto alcun impatto su alcuna specie in via di estinzione o protetta. Ogni campione è stato raccolto in una provetta sterile da microcentrifuga da 15 ml. Per raccogliere il campione, ogni tubo è stato delicatamente immerso nell’acqua, riempito alla profondità selezionata e quindi sigillato. I campioni sono stati mantenuti a 22 °C e prontamente trasportati in laboratorio per l’elaborazione.

Ogni campione è stato concentrato mediante centrifugazione in provette sterili da microcentrifuga da 1,5 mL a 8000 x g per 20 minuti a temperatura ambiente. Questo passaggio è stato ripetuto fino a quando tutti i campioni sono stati concentrati in una provetta, che è stata poi utilizzata per l’estrazione del DNA (Figura 1C).

Figura 1: Concentrazione di campioni d’acqua per centrifugazione. (A) Stagni di campionamento dell’acqua e (B) Corsi d’acqua naturali. (C) Trattamento del campione d’acqua basato sulla centrifugazione in fasi ripetute tutte le volte necessarie (n). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Estrazione del DNA
Il DNA totale è stato isolato utilizzando un kit di DNA genomico commerciale secondo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali). Le estrazioni di DNA sono state eluite in 20 μL di tampone di eluizione e la concentrazione di DNA è stata determinata da uno spettrofotometro UV a 260-280 nm e conservata a 4 °C fino all’uso.

Amplificazione PCR
I bersagli della PCR erano i geni 16S rRNA, lipL41 e lipL32, che identificano il DNA del genere Leptospira e consentono la distinzione tra i tre cladi: patogeno, saprofita e intermedio. Sia i primer che i progetti delle sonde si basavano sui precedenti lavori di Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al. e Branger et al.33,34,35,36,37. La sequenza di ciascuna sonda, primer e frammento amplificato è descritta nella Tabella 1 e il loro allineamento con le sequenze di riferimento è fornito nel File supplementare 1, nel File supplementare 2, nel File supplementare 3, nel File supplementare 4 e nel File supplementare 5. I reagenti PCR e le condizioni di termociclo sono descritti nella sezione del protocollo.

I prodotti di amplificazione sono stati visualizzati mediante separazione elettroforetica su un gel di agarosio all’1% in TAE (40 mM di base Tris, 20 mM di acido acetico e 1 mM di EDTA; pH 8,3), a 60 V per 45 minuti con rilevamento di etidio-bromuro, come mostrato nella Figura 1 supplementare. Il DNA genomico ottenuto da ciascun sierotipo è stato utilizzato con concentrazioni comprese tra 6 x 10⁶ e 1 x 10⁴ copie genomiche equivalenti (GEq) in ciascuna reazione di PCR, in base alla dimensione del genoma di L. interrogans (4, 691, 184 bp)³⁸ per la Leptospira patogena, la dimensione del genoma di L. biflexa (3, 956, 088 bp)³⁹ per la Leptospira saprofita, e la dimensione del genoma del sierotipo di L. fainei ceppo di Hurstbridge BUT6 (4, 267, 324 bp) con numero di adesione AKWZ00000000.2.

La sensibilità delle sonde è stata valutata con il DNA di ciascun sierotipo patogeno, L. biflexa sierotipo Patoc ceppo Patoc I e L. fainei sierotipo Hurstbridge ceppo BUT6 in ogni esperimento. Per valutare la specificità del test di ibridazione PCR e dot-blot, è stato incluso il DNA di batteri non correlati.

Tabella 1: Primer e sonde PCR per amplificare i prodotti per l’identificazione dei cladi patogeni, saprofiti e intermedi di Leptospira. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Saggio di ibridazione dot-blot
La tecnica è chiamata dot-blot perché i fori in cui viene posizionato il campione di DNA hanno una forma a punti, e quando vengono aspirati per essere fissati in posizione mediante aspirazione sottovuoto, acquisiscono questa forma. Questa tecnica è stata sviluppata da Kafatos et ^al.40. La tecnica consente la semi-quantificazione di Leptospira in ogni campione positivo alla PCR. Il protocollo consiste in una denaturazione con NaOH 0,4 M a temperatura ambiente, campioni con DNA di Leptospira da 30 ng a 0,05 ng, corrispondenti a 6 x 10⁶ a 1 x 10⁴ leptospiri, vengono tamponati su una membrana di nylon con un apparato dot-blot a 96 pozzetti. Dopo l’immobilizzazione, il DNA viene legato alla membrana mediante esposizione a 120 mJ di luce UV. Ogni sonda di DNA è coniugata con digoxigenina-11 dUTP mediante una fase di catalisi della transferasi terminale all’estremità 3′ (la digoxigenina è uno steroide vegetale ottenuto dalla Digitalis purpurea, usato come reporter⁴¹). A seguito della rigorosa ibridazione della sonda di DNA marcata (50 pmol) alla temperatura specifica sul DNA bersaglio, gli ibridi di DNA vengono visualizzati mediante la reazione di chemiluminescenza con l’anticorpo anti-digoxigenina fosfatasi alcalina coniugato in modo covalente con il suo substrato CSPD. La luminescenza viene catturata dall’esposizione a una pellicola radiografica (Figura 2).

Figura 2: Fasi della procedura per il test PCR-dot-blot. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. Preparazione del campione Concentrare ogni campione d’acqua in provette da microcentrifuga da 1,5 mL mediante centrifugazione a 8.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Ripetere questo passaggio, tutte le volte che è necessario, per concentrare il campione in un volume di 250 μl. Utilizzare il kit di estrazione del DNA secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali). Eseguire la PCR specifica in base alla sonda dot-blot che verr…

Representative Results

Per valutare l’efficacia della tecnica, è stato utilizzato DNA genomico da colture pure di ciascun sierotipo di Leptospira , insieme alla sonda specifica per clade. Le membrane sono state preparate con 100 ng di DNA genomico per reazione PCR per ciascun sierotipo, seguito da otto DNA genomico di batteri non correlati e concentrazioni variabili di DNA genomico dei sierotipi Leptospira ad hoc . Ogni test includeva un controllo positivo, negativo e non modello. Questi DNA genomici non correlati non hanno …

Discussion

Le fasi critiche della tecnica dot-blot includono (1) immobilizzazione del DNA, (2) blocco dei siti di legame liberi sulla membrana con DNA non omologo, (3) la complementarità tra la sonda e il frammento bersaglio in condizioni di ricottura, (4) rimozione della sonda non ibridata e (5) il rilevamento della molecola reporter⁴¹.

La PCR-Dot-blot presenta alcune limitazioni, come la tecnica che non fornisce informazioni sulle dimensioni del frammento^37</s…

Materials

REAGENTS
Purelink DNA extraction kit	Invitrogen	K182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)	Promega	M3001
Whatman filter paper, grade 1,	Merk	WHA1001325
Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m	Roche	11417240001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody	Roche	11093274910
Medium Base EMJH	Difco	S1368JAA
Leptospira Enrichment EMJH	Difco	BD 279510
Blocking Reagent	Roche	11096176001
CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate	Merk	11755633001
Deoxyribonucleic acid from herring sperm	Sigma Aldrich	D3159
Developer Carestream	Carestream Health Inc	GBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTP	Roche	11363905910
EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)	Promega	H5032
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F8016
Fixer Carestream	Carestream Health Inc	GBX 5158605
Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa	Sigma Aldrich	L5750
N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa	Sigma Aldrich	L-9150	It is an anionic surfactant
Polivinylpyrrolidone (PVP-40)	Sigma Aldrich	PVP40
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)	Sigma Aldrich	9005-64-5
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	7647-14-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	151-21-3
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	1310-73-2
Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	7558-79-4
Terminal transferase, recombinant	Roche	3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl)	Sigma-Aldrich	1185-53-1
SSPE 20X	Sigma-Aldrich	S2015-1L	It can be Home-made following Supplementary File 6
Primers	Sigma-Aldrich	On demand	Follow table 1
Probes	Sigma-Aldrich	On demand	Follow table 1
Equipment
Nanodrop™ One Spectrophotometer	Thermo-Scientific	ND-ONE-W
Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm	Sigma-Aldrich	1-14K
Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µl	Gilson	SKU:F167360
Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)	Axygen	MCT-150-SP
Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved)	Axygen	3208
Disposable Pipette tips 1-10 µl	Axygen	T-300
Disposable Pipette tips 1-200 µl	Axygen	TR-222-Y
Dot-Blot apparatus Bio-Dot	BIORAD	1706545
Portable Hergom Suction	Hergom	7E-A
Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)	Hoefer	PH90-115V
UV Crosslinker	Hoefer	UVC-500
Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler	Hybaid	HBPX110
Radiographic cassette with IP Plate14 X 17	Fuji