माइक्रोएरे पॉलिमर प्रोफाइलिंग (एमएपीपी) जैविक नमूनों में ग्लाइकान के रचनात्मक विश्लेषण के लिए एक उच्च-थ्रूपुट तकनीक है।
माइक्रोएरे पॉलिमर प्रोफाइलिंग (एमएपीपी) पौधे और अल्गल ऊतकों, खाद्य सामग्री, और मानव, पशु और माइक्रोबियल नमूनों सहित विभिन्न जैविक नमूनों के भीतर ग्लाइकान और ग्लाइकोकोनजुगेट्स की संरचना और सापेक्ष बहुतायत को व्यवस्थित रूप से निर्धारित करने के लिए एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दृष्टिकोण है। माइक्रोएरे तकनीक एक लघु, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म प्रदान करके इस पद्धति की प्रभावकारिता को कम करती है, जिससे ग्लाइकान और अत्यधिक विशिष्ट ग्लाइकन-निर्देशित आणविक जांच के बीच हजारों इंटरैक्शन को सहवर्ती रूप से विशेषता दी जा सकती है, केवल थोड़ी मात्रा में विश्लेषणों का उपयोग करके। घटक ग्लाइकान रासायनिक और एंजाइमेटिक रूप से खंडित होते हैं, क्रमिक रूप से नमूने से निकाले जाने से पहले और सीधे नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर स्थिर होते हैं। ग्लाइकन संरचना विशिष्ट ग्लाइकन-पहचानने वाले आणविक जांच के लगाव से निर्धारित होती है जो कि जबरन और मुद्रित अणुओं के लिए होती है। एमएपीपी पारंपरिक ग्लाइकन विश्लेषण तकनीकों का पूरक है, जैसे मोनोसैकराइड और लिंकेज विश्लेषण और मास स्पेक्ट्रोमेट्री। हालांकि, ग्लाइकन-पहचानने वाले आणविक जांच ग्लाइकान के संरचनात्मक विन्यास में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, जो जैविक बातचीत और कार्यात्मक भूमिकाओं को स्पष्ट करने में सहायता कर सकते हैं।
ग्लाइकान जीवन के सभी डोमेन में सर्वव्यापी हैं और अन्य मैक्रोमोलेक्यूल्स की तुलना में संरचना और कार्य में अद्वितीय विविधता प्रदर्शितकरते हैं। हालांकि, उनकी जटिलता के कारण, जैवसंश्लेषण और ग्लाइकोसिडिक संबंधों में परिवर्तनशीलता, और ग्लाइकन संरचनाओं को विदारक करने के लिए उपयुक्त तरीकों की कमी, संरचनाओं और कार्यों में इस विविधता की हमारी समझ अपेक्षाकृत सीमित है2.
कई ग्लाइकन विश्लेषण तकनीकें विनाशकारी हैं और ग्लाइकान के टूटने को उनके घटक मोनोसेकेराइड में तोड़ने की आवश्यकता होती है, जो प्रासंगिक त्रि-आयामी और जैविक संदर्भों को अस्पष्ट कर सकती हैं3. इसके विपरीत, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबीएस), कार्बोहाइड्रेट बाइंडिंग मॉड्यूल (सीबीएम), लेक्टिन, वायरल एग्लूटीनिन और माइक्रोबियल आसंजन, जिन्हें सामूहिक रूप से ग्लाइकन-पहचानने वाले आणविक जांच (जीआरएमपी)4के रूप में जाना जाता है, विशिष्ट एपिटोप्स को पहचानते हैं और बांधते हैं और जटिल मल्टी-ग्लाइकन मैट्रिसेस 5,6 के भीतर ग्लाइकान के बीच पता लगाने और भेदभाव करने के लिए उपकरण के रूप में उपयोग किया जा सकता है।
यहां, हम माइक्रोएरे पॉलिमर प्रोफाइलिंग (एमएपीपी), ग्लाइकन विश्लेषण के लिए एक तेजी से, बहुमुखी और गैर-विनाशकारी विधि प्रस्तुत करते हैं जो जैविक नमूनों के व्यापक स्पेक्ट्रम पर लागू होता है। विधि का उद्देश्य विविध जैविक और औद्योगिक/वाणिज्यिक प्रणालियों से ग्लाइकान का विश्लेषण करने के लिए एक मजबूत और उच्च-थ्रूपुट तकनीक प्रदान करना है। एमएपीपी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, उच्च प्रदर्शन माइक्रोएरे स्क्रीनिंग तकनीक के साथ ग्लाइकन-निर्देशित आणविक जांच की मान्यता विशिष्टता को एकजुट करता है ताकि हजारों आणविक इंटरैक्शन को समानांतर में प्रोफाइल किया जा सके। इस दृष्टिकोण का उत्पादन एक नमूना या ब्याज के ऊतक के भीतर ग्लाइकान की संरचना और सापेक्ष बहुतायत में नैदानिक अंतर्दृष्टि है।
एमएपीपी का उपयोग एक स्वतंत्र, स्टैंड-अलोन विधि के रूप में किया जा सकता है, या अन्य जैव रासायनिक तकनीकों के साथ संयोजन के रूप में किया जा सकता है, जैसे कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी 7,8,9 और मोनोसैकराइड या लिंकेज विश्लेषण10,11। तकनीक भी उपन्यास GRMPs के epitope विशिष्टताओं नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, शुद्ध और संरचनात्मक अच्छी तरह से परिभाषित oligosaccharide मानकों12 के साथ मुद्रित सरणियों का उपयोग कर. एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) जैसे अन्य तरीकों पर एमएपीपी का एक बड़ा फायदा यह है कि छोटे नमूना संस्करणों13,14 के साथ इसकी संगतता है। इसके अलावा, एमएपीपी काफी उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण15 प्रदान करता है और नमूना संरक्षण का एक प्रभावी रूप प्रदान करता है, क्योंकि मुद्रित नमूने नाइट्रोसेल्यूलोज16 पर स्थिर होने पर शुष्क और स्थिर होते हैं।
जीआरएमपी का बंधन आम तौर पर कई सन्निहित चीनी अवशेषों की उपस्थिति पर निर्भर करता है जो सामूहिक रूप से एक बाध्यकारी साइट (एपिटोप) बनाते हैं जो एक विशेष पॉलीसेकेराइड वर्ग (ज़ाइलान, मन्नान, ज़ाइलोग्लुकन, आदि) के लिए अद्वितीय है। 17. इसके विपरीत, व्यक्तिगत चीनी अवशेष (जाइलोज, मैनोज, ग्लूकोज) जो अधिकांश जैव रासायनिक तकनीकों का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की जाती है, उदाहरण के लिए मोनोसैकराइड संरचना या मिथाइलेशन विश्लेषण, कई पॉलीसेकेराइड वर्गों के घटक हो सकते हैं और इस प्रकार18 को असाइन करना मुश्किल है।
एमएपीपी को एक प्रौद्योगिकी अंतराल के जवाब में विकसित किया गया है, अर्थात् छोटी मात्रा में सामग्री का उपयोग करके विभिन्न स्रोतों से कई ग्लाइकान का तेजी से विश्लेषण करने की क्षमता। एमएपीपी जीआरएमपी के व्यापक प्रदर्शनों की सूची को भुनाता है जिन्हें पिछले तीन दशकों में विकसित और विशेषता दी गई है 12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. एमएपीपी का विकास एक पुनरावृत्ति प्रक्रिया रही है, जिसमें तकनीक को लगातार परिष्कृत और अनुकूलित किया जा रहा है। अब विभिन्न प्राकृतिक और औद्योगिक प्रणालियों में एमएपीपी के अनुप्रयोग का वर्णन करने वाले साहित्य का एक बड़ा निकाय है जहां ग्लाइकान केंद्रीय भूमिका निभाते हैं 5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39. यहां, हम एमएपीपी के लिए कला की वर्तमान स्थिति का वर्णन करते हैं।
यहाँ वर्णित एमएपीपी तकनीक अब ग्लाइकन विश्लेषण के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है। बुनियादी सिद्धांतों को पहली बार 200711 में वर्णित किया गया था, लेकिन माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी, आणविक जांच विकास और ग्लाइकन जैव रसायन की हमारी समझ में प्रगति में नवीनतम नवाचारों को भुनाने के लिए तकनीक का निरंतर विकास हुआ है। सामान्य तौर पर, ग्लाइकान, विशेष रूप से पॉलीसेकेराइड, प्रोटीन और न्यूक्लियोटाइड की तुलना में उनकी संरचनात्मक जटिलता और विषमता45 के कारण विश्लेषण करने के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण होते हैं, साथ ही तथ्य यह है कि उन्हें आसानी से अनुक्रमित या संश्लेषित नहीं किया जा सकताहै 1. कई मामलों में, कोई भी तकनीक ग्लाइकन जटिलता को निर्णायक रूप से नहीं समझ सकती है; इस प्रकार, एमएपीपी का उपयोग अक्सर अन्य तरीकों से किया जाता है। यह एक कारण है कि एआईआर तैयारी को आमतौर पर एमएपीपी के लिए शुरुआती बिंदु के रूप में चुना जाता है, क्योंकि एआईआर अधिकांश अन्य ग्लाइकन विश्लेषण विधियों34 के साथ संगत है, जिससे डेटासेट की बाद की तुलना की सुविधा मिलती है।
आकाशवाणी की तैयारी से पहले नमूने के समरूपीकरण के कारण, कुछ स्थानिक जानकारी हमेशा खो जाती है। हालांकि, के रूप में polysaccharides क्रमिक नमूने से जारी कर रहे हैं, प्राप्त अंशों में epitopes की उपस्थिति आणविक वास्तुकला और उस नमूना17 की संरचना के बारे में जानकारी प्रदान करता है. इस प्रकार, एक उपयुक्त निष्कर्षण शासन का चयन विधि की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. एकाधिक पैरामीटर निष्कर्षण विधि की उपयुक्तता निर्धारित करते हैं: सेलुलर संरचना, समय, तापमान, पीएच, दबाव, विलायक की आयनिक शक्ति, और ठोस कण नमूना49 की सुंदरता। यह अनुशंसा की जाती है कि तेजी से अधिक आक्रामक सॉल्वैंट्स की एक श्रृंखला का उपयोग घटक ग्लाइकान को सफलतापूर्वक निकालने और नमूने की प्रतिनिधि रचनात्मक तस्वीर बनाने की संभावना को अधिकतम करने के लिए किया जाता है। अधिकांश नमूनों के लिए, सीडीटीए, एनएओएच, और सेल्यूलस पौधे से व्युत्पन्न भंडारण और सेल दीवार पॉलीसेकेराइड 33,50,51,52 को हटाने के लिए पर्याप्त हैं। कुछ ऊतक नमूनों के लिए, एक हाइब्रिड निष्कर्षण शासन जिसमें CaCl2, HCl, और Na2CO3 भी शामिल हैं, को सफल53 दिखाया गया है, जबकि समुद्री माइक्रोलेगल नमूनों को एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड (EDTA)10के अतिरिक्त की आवश्यकता हो सकती है।
माइक्रोएरे में सकारात्मक नियंत्रण5 के रूप में उपयोग किए जाने वाले शुद्ध, परिभाषित ग्लाइकन मानकों की एक श्रृंखला शामिल होनी चाहिए। शामिल मानकों को नमूने की प्रकृति के अनुसार संशोधित किया जाना चाहिए। एक बार मुद्रित होने के बाद, उपयुक्त जीआरएमपी का चयन करने की आवश्यकता होती है। पॉलीसेकेराइड संरचनाओं के लिए हाइब्रिडोमा एमएबी की पीढ़ीचुनौतीपूर्ण 54 है; ग्लाइकन-बाइंडिंग एंटीबॉडी को उठाना मुश्किल होता है और कम आत्मीयता55 हो सकती है। सौभाग्य से, सीबीएम के लिए जीन अनुक्रम जानकारी पुनः संयोजक अभिव्यक्ति4 और इंजीनियरिंग उनके बाध्यकारी विशिष्टताओं56,57 के लिए सापेक्ष आसानी के साथ प्राप्त किया जा सकता है. जबकि जीआरएमपी की एक प्रभावशाली सूची विकसित की गई है, जिसमें अब वाणिज्यिक स्रोतों से उपलब्ध है, प्रकृति में मौजूद ग्लाइकन संरचनाओं की विविधता के सापेक्ष, केवल एक छोटा सा अनुपात उत्पादित किया गया है और सफलतापूर्वक58 की विशेषता है। यह कुछ संरचनाओं के बीच पता लगाने और भेदभाव करने की क्षमता को सीमित कर सकता है। यह प्रत्येक प्रमुख glycan संरचना के एक या दो जांच प्रतिनिधि मौजूद होने के लिए प्रत्याशित, जिसके लिए बाध्यकारी विशिष्टता अच्छी तरह से विशेषता है का उपयोग कर एक प्रारंभिक जांच प्रयोग प्रदर्शन करने के लिए सलाह दी जाती है. बाद के जांच प्रयोगों में, जांच सूची glycans की एक विस्तृत रेंज को कवर करने और ठीक संरचनाओं में गहराई से तल्लीन करने के लिए विस्तार किया जा सकता है.
हालांकि सांसारिक, यह सुनिश्चित करना कि प्रत्येक इनक्यूबेशन चरण के बाद माइक्रोएरे को अच्छी तरह से धोया जाता है, जांच प्रक्रिया की सफलता के लिए मौलिक है। गैर-विशेष रूप से बाध्य जांच के अप्रभावी हटाने से रंग विकास के बाद एक उच्च पृष्ठभूमि संकेत पैदा करके परिणाम को अस्पष्ट करने की संभावना है। इस मामले में, एक नए माइक्रोएरे से शुरू होने वाली जांच प्रक्रिया को दोहराना आवश्यक है। इसके अलावा, सरणियों संयम से छुआ जाना चाहिए और केवल संदंश के साथ किनारों पकड़कर; नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली भंगुर और आसानी से क्षतिग्रस्त होती है। रंग विकास समाधान दरारें और क्रीज में इकट्ठा होता है, जिससे अतिसंतृप्ति होती है, जो सरणी विश्लेषण को बाधित करती है।
एमएपीपी त्वरित, अनुकूलनीय और सुविधाजनक है। यह विधि किसी भी जैविक या औद्योगिक प्रणाली से प्राप्त पशु, माइक्रोबियल, या पौधे ग्लाइकान के साथ संगत है, जब तक कि उन्हें नाइट्रोसेल्यूलोज पर निकाला और स्थिर किया जा सकता है, और जिसके लिए किसी के पास उपयुक्त आणविक जांच है। उत्पन्न डेटा विस्तृत, अर्ध-मात्रात्मक, रचनात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, जिसे अन्य ग्लाइकन विश्लेषण विधियों के माध्यम से आसानी से प्राप्त नहीं किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक माइक्रोएरे रोबोटिक्स के बारे में उनकी विशेषज्ञ सलाह के लिए ArrayJet को स्वीकार करना चाहते हैं। एसएस और जेएस फंडामेंटल फंड 2022 (एफएफ 65/004), चियांग माई विश्वविद्यालय से समर्थन को स्वीकार करना चाहेंगे।
1,3:1,4-β-D-Glucan, Lichenan (icelandic moss) | Megazyme | P-LICHN | |
1,4-β-D-Mannan | Megazyme | P-MANCB | |
384-well microtiter plate | Greiner Bio-One | M1686 | |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Melford | B74100-1.0 | |
Acetone | Sigma | 270725 | |
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-055-003 | |
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 112-055-003 | |
Alkaline Phosphatase AffiniPure Rabbit Anti-His Tag | Jackson ImmunoResearch | 300-055-240 | |
Arabinoxylan (wheat) | Megazyme | P-WAXYL | |
Array-Pro Analyzer Software | Media Cybernetics | Version 6.3 | |
Bacillus sp. Cellulase 5A (BCel5A) | NZYTech | CZ0564 | |
BAM antibodies | SeaProbes | Various | |
Black drawing ink (indian ink) | Winsor & Newton | GWD030 | |
Carbohydrate binding modules | NZYTech | Various | |
CCRC antibodies | CarboSource | Various | |
CDTA | Sigma | 319945 | |
Chloroform | Sigma | PHR1552 | |
Ethanol | Sigma | 1.11727 | |
Galactan (potato) | Megazyme | P-GALPOT | |
Galactomannan (carob) | Megazyme | P-GALML | |
Glycerol solution | Sigma | 49781-5L | |
Gum tragacanth (legumes) | Sigma-Aldrich | G1128 | |
INCh antibodies | INRA | Various | |
LM and JIM antibodies | PlantProbes | Various | |
Marathon Argus Microarray Printer | ArrayJet | ||
Methanol | Sigma | 34860 | |
Monoclonal antibodies | Biosupplies Australia | Various | |
NaBH4 | Sigma | 452882 | |
NaOH | Sigma | S5881 | |
Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Melford | N66000-1.0 | |
Nitrocellulose membrane | Thermo Fisher Scientific | 88018 | |
Pectin (degree of methyl esterification 46%) | Danisco | NA | |
ProClin 200 | Sigma | 48171-U | |
Rhamnogalacturonan (soybean pectic fibre) | Megazyme | P-RHAGN | |
Rotating mixer | Fisher Scientific | 88-861-050 | |
Rotating/rocking Shaker | Cole-Parmer | ||
Skimmed milk powder | Marvel | ||
Spin filter | Costar Spin-X | 8160 | |
Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
Tris | Sigma | 93362 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | |
Xylan (beechwood) | Megazyme | P-XYLNBE | |
Xyloglucan (tamarind) | Megazyme | P-XYGLN | |
β-Glucan (oat) | Megazyme | P-BGOM |