Microarray polymer profiling (MAPP) är en teknik med hög genomströmning för kompositionsanalys av glykaner i biologiska prover.
Microarray polymer profiling (MAPP) är en robust och reproducerbar metod för att systematiskt bestämma sammansättningen och den relativa förekomsten av glykaner och glykokonjugat i en mängd olika biologiska prover, inklusive växt- och algvävnader, livsmedelsmaterial och prover från människor, djur och mikrober. Microarray-tekniken stöder effektiviteten av denna metod genom att tillhandahålla en miniatyriserad, högkapacitetsscreeningsplattform, vilket gör det möjligt att karakterisera tusentals interaktioner mellan glykaner och mycket specifika glykanriktade molekylära sonder samtidigt, med endast små mängder analyter. Ingående glykaner fraktioneras kemiskt och enzymatiskt innan de extraheras sekventiellt från provet och immobiliseras direkt på nitrocellulosamembran. Glykansammansättningen bestäms genom fastsättning av specifika glykanigenkännande molekylära sonder till de utpressade och tryckta molekylerna. MAPP är ett komplement till konventionella glykananalystekniker, såsom monosackarid- och kopplingsanalys och masspektrometri. Molekylära sonder som känner igen glykaner ger dock insikt i de strukturella konfigurationerna av glykaner, vilket kan hjälpa till att belysa biologiska interaktioner och funktionella roller.
Glykaner är allestädes närvarande i alla livets domäner och uppvisar oöverträffad mångfald i struktur och funktion jämfört med andra makromolekyler1. Men på grund av deras komplexitet, variabilitet i biosyntes och glykosidbindningar, och bristen på lämpliga metoder för att dissekera glykanstrukturer, är vår förståelse av denna mångfald i strukturer och funktionerrelativt begränsad.
Många glykananalystekniker är destruktiva och kräver nedbrytning av glykaner i deras beståndsdelar monosackarider, vilket kan dölja relevanta tredimensionella och biologiska sammanhang3. Omvänt känner monoklonala antikroppar (mAbs), kolhydratbindningsmoduler (CBM), lektiner, virala agglutininer och mikrobiella adhesiner, kända som glykanigenkännande molekylära sonder (GRMP)4, igen och binder till specifika epitoper och kan användas som verktyg för att detektera och skilja mellan glykaner inom komplexa multiglykanmatriser 5,6.
Här presenterar vi microarray polymer profiling (MAPP), en snabb, mångsidig och icke-destruktiv metod för glykananalys som är tillämplig på ett brett spektrum av biologiska prover. Metoden syftar till att tillhandahålla en robust och högkapacitetsteknik för analys av glykaner från olika biologiska och industriella/kommersiella system. MAPP förenar igenkänningsspecificiteten hos glykanriktade molekylära prober med reproducerbar, högpresterande mikroarrayscreeningsteknik för att möjliggöra att tusentals molekylära interaktioner kan profileras parallellt. Resultatet av detta tillvägagångssätt är diagnostisk insikt i sammansättningen och den relativa förekomsten av glykaner i ett prov eller en vävnad av intresse.
MAPP kan användas som en fristående, fristående metod, eller i kombination med andra biokemiska tekniker, såsom immunofluorescensmikroskopi 7,8,9 och monosackarid- eller bindningsanalys10,11. Tekniken kan också användas för att kartlägga epitopspecificiteter hos nya GRMP, med hjälp av arrayer tryckta med rena och strukturellt väldefinierade oligosackaridstandarder12. En stor fördel med MAPP jämfört med andra metoder, såsom enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA), är dess kompatibilitet med små provvolymer13,14. Dessutom erbjuder MAPP betydligt högre genomströmningsanalys15 och ger en effektiv form av provkonservering, eftersom tryckta prover är torra och stabila när de immobiliseras på nitrocellulosa16.
Bindningen av GRMP är i allmänhet beroende av närvaron av ett antal sammanhängande sockerrester som tillsammans bildar ett bindningsställe (epitop) som är unikt för en viss polysackaridklass (xylan, mannan, xyloglukan, etc.) 17. Däremot kan de enskilda sockerresterna (xylos, mannos, glukos) som kvantifieras med hjälp av de flesta biokemiska tekniker, till exempel monosackaridsammansättning eller metyleringsanalys, vara komponenter i flera polysackaridklasser och därför svåra att klassificera18.
MAPP har utvecklats som svar på ett teknikgap, nämligen förmågan att snabbt analysera flera glykaner från en mängd olika källor med hjälp av små mängder material. MAPP drar nytta av den omfattande repertoar av GRMP som har utvecklats och karakteriserats under de senaste tre decennierna 12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 . Utvecklingen av MAPP har varit en iterativ process, där tekniken stadigt förfinats och optimerats. Det finns nu en betydande mängd litteratur som beskriver tillämpningen av MAPP på olika naturliga och industriella system där glykaner spelar centrala roller 5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39. Här beskriver vi det aktuella läget för MAPP.
MAPP-tekniken som beskrivs här är nu en väletablerad metod för glykananalys. De grundläggande principerna beskrevs första gången 200711, men tekniken har genomgått kontinuerlig utveckling för att dra nytta av de senaste innovationerna inom mikroarrayteknik, molekylär sondutveckling och framsteg i vår förståelse av glykanbiokemi. I allmänhet är glykaner, särskilt polysackarider, mer utmanande att analysera än proteiner och nukleotider på grund av deras strukturella komplexitet och heterogenitet45, samt det faktum att de inte lätt kan sekvenseras eller syntetiseras1. I många fall kan ingen enskild teknik dechiffrera glykankomplexitet slutgiltigt; därför används MAPP ofta med andra metoder. Detta är en av anledningarna till att AIR-beredning vanligtvis väljs som utgångspunkt för MAPP, eftersom AIR är kompatibel med de flesta andra glykananalysmetoder34, vilket underlättar den efterföljande jämförelsen av datauppsättningar.
På grund av homogenisering av provet före AIR-beredning går viss rumslig information alltid förlorad. Men eftersom polysackarider frisätts sekventiellt från prover, ger närvaron av epitoper i de erhållna fraktionerna information om den molekylära arkitekturen och sammansättningen av det provet17. Att välja en lämplig extraktionsregim är därför avgörande för metodens framgång. Flera parametrar avgör extraktionsmetodens lämplighet: cellstruktur, tid, temperatur, pH, tryck, lösningsmedlets jonstyrka och finheten hos det fasta partikelprovet49. Det rekommenderas att en rad allt mer aggressiva lösningsmedel används för att maximera sannolikheten för att framgångsrikt extrahera ingående glykaner och bygga upp en representativ sammansättningsbild av provet. För de flesta prover är CDTA, NaOH och cellulas tillräckliga för att avlägsna växtbaserade lagrings- och cellväggspolysackarider 33,50,51,52. För vissa vävnadsprover har en hybridextraktionsregim som även inkluderar CaCl2, HCl och Na2CO3 visat sig vara framgångsrik53, medan marina mikroalgprover kan kräva tillsats av etylendiamintetraättiksyra (EDTA)10.
Mikroarrayer bör innehålla en rad rena, definierade glykanstandarder som ska användas som positiva kontroller5. Inkluderade standarder bör modifieras beroende på provets karaktär. När de har skrivits ut måste lämpliga GRMP:er väljas. Genereringen av hybridom-mAbs till polysackaridstrukturer är utmanande54; Glykanbindande antikroppar är svåra att höja och kan ha låg affinitet55. Lyckligtvis kan gensekvensinformation för CBM erhållas relativt enkelt för rekombinant uttryck4 och för att modifiera deras bindningsspecificiteter56,57. Även om en imponerande katalog över GRMP har utvecklats, och de flesta nu finns tillgängliga från kommersiella källor, har endast en liten andel producerats och framgångsrikt karakteriserats58 i förhållande till den mångfald av glykanstrukturer som finns i naturen. Detta kan begränsa möjligheten att upptäcka och skilja mellan vissa strukturer. Det är tillrådligt att utföra ett inledande sonderingsexperiment med en eller två sonder som är representativa för varje större glykanstruktur som förväntas finnas, för vilken bindningsspecificiteten är väl karakteriserad. I efterföljande sonderingsexperiment kan sondlistan utökas till att omfatta ett bredare spektrum av glykaner och fördjupa sig i finstrukturer.
Även om det är vardagligt, är det grundläggande att se till att mikroarrayer tvättas noggrant efter varje inkubationssteg för att sonderingsproceduren ska lyckas. Det ineffektiva avlägsnandet av icke-specifikt bundna sonder kommer sannolikt att skymma resultatet genom att orsaka en hög bakgrundssignal efter färgutvecklingen. I det här fallet är det nödvändigt att upprepa sonderingsproceduren och börja med en ny mikroarray. Dessutom bör arrayer vidröras sparsamt och endast genom att hålla i kanterna med pincett; Nitrocellulosamembranet är sprött och skadas lätt. Färgutvecklingslösningen samlas i sprickor och veck, vilket orsakar övermättnad, vilket hindrar matrisanalys.
MAPP är snabbt, anpassningsbart och bekvämt. Denna metod är kompatibel med djur-, mikrobiella eller växtglykaner som härrör från alla biologiska eller industriella system, så länge de kan extraheras och immobiliseras på nitrocellulosa, och för vilka man har lämpliga molekylära sonder. De data som genereras ger detaljerad, semikvantitativ, kompositionell insikt, som inte lätt kan erhållas via andra glykananalysmetoder.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka ArrayJet för deras expertråd om mikroarrayrobotik. SS och JS vill tacka för stödet från Fundamental Fund 2022 (FF65/004), Chiang Mai University.
1,3:1,4-β-D-Glucan, Lichenan (icelandic moss) | Megazyme | P-LICHN | |
1,4-β-D-Mannan | Megazyme | P-MANCB | |
384-well microtiter plate | Greiner Bio-One | M1686 | |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Melford | B74100-1.0 | |
Acetone | Sigma | 270725 | |
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-055-003 | |
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 112-055-003 | |
Alkaline Phosphatase AffiniPure Rabbit Anti-His Tag | Jackson ImmunoResearch | 300-055-240 | |
Arabinoxylan (wheat) | Megazyme | P-WAXYL | |
Array-Pro Analyzer Software | Media Cybernetics | Version 6.3 | |
Bacillus sp. Cellulase 5A (BCel5A) | NZYTech | CZ0564 | |
BAM antibodies | SeaProbes | Various | |
Black drawing ink (indian ink) | Winsor & Newton | GWD030 | |
Carbohydrate binding modules | NZYTech | Various | |
CCRC antibodies | CarboSource | Various | |
CDTA | Sigma | 319945 | |
Chloroform | Sigma | PHR1552 | |
Ethanol | Sigma | 1.11727 | |
Galactan (potato) | Megazyme | P-GALPOT | |
Galactomannan (carob) | Megazyme | P-GALML | |
Glycerol solution | Sigma | 49781-5L | |
Gum tragacanth (legumes) | Sigma-Aldrich | G1128 | |
INCh antibodies | INRA | Various | |
LM and JIM antibodies | PlantProbes | Various | |
Marathon Argus Microarray Printer | ArrayJet | ||
Methanol | Sigma | 34860 | |
Monoclonal antibodies | Biosupplies Australia | Various | |
NaBH4 | Sigma | 452882 | |
NaOH | Sigma | S5881 | |
Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Melford | N66000-1.0 | |
Nitrocellulose membrane | Thermo Fisher Scientific | 88018 | |
Pectin (degree of methyl esterification 46%) | Danisco | NA | |
ProClin 200 | Sigma | 48171-U | |
Rhamnogalacturonan (soybean pectic fibre) | Megazyme | P-RHAGN | |
Rotating mixer | Fisher Scientific | 88-861-050 | |
Rotating/rocking Shaker | Cole-Parmer | ||
Skimmed milk powder | Marvel | ||
Spin filter | Costar Spin-X | 8160 | |
Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
Tris | Sigma | 93362 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | |
Xylan (beechwood) | Megazyme | P-XYLNBE | |
Xyloglucan (tamarind) | Megazyme | P-XYGLN | |
β-Glucan (oat) | Megazyme | P-BGOM |