Un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali

Summary

I siti di contatto mitocondriali sono complessi proteici che interagiscono con le proteine della membrana interna ed esterna mitocondriale. Questi siti sono essenziali per la comunicazione tra le membrane mitocondriali e, quindi, tra il citosol e la matrice mitocondriale. In questo articolo, descriviamo un metodo per identificare i candidati che si qualificano per questa specifica classe di proteine.

Abstract

I mitocondri sono presenti praticamente in tutte le cellule eucariotiche e svolgono funzioni essenziali che vanno ben oltre la produzione di energia, ad esempio la sintesi di cluster ferro-zolfo, lipidi o proteine, il tamponamento di Ca²⁺ e l’induzione dell’apoptosi. Allo stesso modo, la disfunzione mitocondriale provoca gravi malattie umane come il cancro, il diabete e la neurodegenerazione. Per svolgere queste funzioni, i mitocondri devono comunicare con il resto della cellula attraverso il loro involucro, che consiste di due membrane. Pertanto, queste due membrane devono interagire costantemente. I siti di contatto proteici tra la membrana mitocondriale interna ed esterna sono essenziali in questo senso. Finora sono stati identificati diversi siti di contatto. Nel metodo qui descritto, i mitocondri di Saccharomyces cerevisiae vengono utilizzati per isolare i siti di contatto e, quindi, identificare i candidati che si qualificano per le proteine del sito di contatto. Abbiamo usato questo metodo per identificare il complesso MICOS (Mitochondrial Contact Site and Cristae Organizing System), uno dei principali complessi di formazione del sito di contatto nella membrana interna mitocondriale, che si conserva dal lievito all’uomo. Recentemente, abbiamo ulteriormente migliorato questo metodo per identificare un nuovo sito di contatto costituito da Cqd1 e dal complesso Por1-Om14.

Introduction

I mitocondri svolgono una varietà di funzioni diverse negli eucarioti, la più nota delle quali è la produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa. Altre funzioni includono la produzione di cluster ferro-zolfo, la sintesi lipidica e, negli eucarioti superiori, la segnalazione di Ca²⁺ e l’induzione dell’apoptosi 1,2,3,4. Queste funzioni sono indissolubilmente legate alla loro complessa ultrastruttura.

L’ultrastruttura mitocondriale è stata descritta per la prima volta al microscopio elettronico⁵. È stato dimostrato che i mitocondri sono organelli piuttosto complessi costituiti da due membrane: la membrana esterna mitocondriale e la membrana interna mitocondriale. Pertanto, da queste membrane si formano due compartimenti acquosi: lo spazio intermembrana e la matrice. La membrana interna mitocondriale può essere ulteriormente suddivisa in diverse sezioni. La membrana perimetrale interna rimane in prossimità della membrana esterna e le cristae formano invaginazioni. Le cosiddette giunzioni crista collegano la membrana perimetrale interna e le cristae (Figura 1). Inoltre, le micrografie elettroniche dei mitocondri osmoticamente ridotti rivelano che esistono siti in cui le membrane mitocondriali sono strettamente collegate ^6,7. Questi cosiddetti siti di contatto sono formati da complessi proteici che attraversano le due membrane (Figura 1). Si ritiene che questi siti di interazione siano essenziali per la vitalità cellulare a causa della loro importanza per la regolazione della dinamica mitocondriale e dell’ereditarietà, nonché per il trasferimento di metaboliti e segnali tra il citosol e la matrice⁸.

Il complesso MICOS nella membrana interna mitocondriale è probabilmente il complesso di formazione del sito di contatto meglio caratterizzato e più versatile. MICOS è stato descritto nel lievito nel 2011 ed è costituito da sei subunità 9,10,1 ¹: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19^, Mic12 e ^Mic10. Questi formano un complesso di circa 1,5 MDa che si localizza alle giunzioni^crista 9,10,11. La delezione di una delle due subunità principali, Mic10 o Mic60, porta all’assenza di questo complesso ^9,11, il che significa che queste due subunità sono essenziali per la stabilità di MICOS. È interessante notare che MICOS forma non solo uno, ma più siti di contatto con varie proteine e complessi della membrana esterna mitocondriale: il complesso TOM 11,12, il complesso TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, il complesso Fzo1-Ugo1⁹, Por1 10^, OM45 10 e Miro ¹⁷. Ciò indica fortemente che il complesso MICOS è coinvolto in vari processi mitocondriali, come l’importazione di proteine, il metabolismo dei fosfolipidi e la generazione dell’ultrastruttura mitocondriale¹⁸. Quest’ultima funzione è probabilmente la funzione principale di MICOS, in quanto l’assenza del complesso MICOS indotta attraverso la delezione di MIC10 o MIC60 porta ad un’ultrastruttura mitocondriale anomala che manca praticamente completamente di cristae regolari. Invece, le vescicole della membrana interna senza connessione alla membrana di confine interna si accumulano^{19, 20}. È importante sottolineare che MICOS è conservato nella forma e nella funzione dal lievito all’uomo²¹. L’associazione delle mutazioni nelle subunità MICOS con gravi malattie umane sottolinea anche la sua importanza per gli eucarioti superiori^22,23. Sebbene MICOS sia altamente versatile, devono esistere ulteriori siti di contatto (sulla base delle nostre osservazioni non pubblicate). Infatti, sono stati identificati diversi altri siti di contatto, ad esempio i meccanismi di fusione mitocondriale Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 o Mdm31-Por1^, che è coinvolto nella biosintesi del fosfolipide mitocondriale specifico cardiolipina ²⁷. Recentemente, abbiamo migliorato il metodo che ci ha portato all’identificazione di MICOS per identificare Cqd1 come parte di un nuovo sito di contatto formato con il complesso di membrana esterna Por1-Om14²⁸. È interessante notare che questo sito di contatto sembra anche essere coinvolto in molteplici processi come l’omeostasi della membrana mitocondriale, il metabolismo dei fosfolipidi e la distribuzione del coenzima Q^28,29.

Qui, abbiamo usato una variazione del frazionamento dei mitocondri 9,30,31,32,33 precedentemente descritto. Il trattamento osmotico dei mitocondri porta alla rottura della membrana esterna mitocondriale e ad un restringimento dello spazio della matrice, lasciando le due membrane solo in stretta vicinanza nei siti di contatto. Ciò consente la generazione di vescicole costituite esclusivamente da membrana esterna mitocondriale o membrana interna mitocondriale o in siti di contatto contenuti di entrambe le membrane attraverso una lieve sonicazione. A causa della membrana interna mitocondriale che possiede un rapporto proteine-lipidi molto più elevato, le vescicole della membrana interna mitocondriale presentano una densità maggiore rispetto alle vescicole della membrana esterna mitocondriale. La differenza di densità può essere utilizzata per separare le vescicole di membrana attraverso la centrifugazione a gradiente di densità galleggiante del saccarosio. Pertanto, le vescicole della membrana esterna mitocondriale si accumulano a basse concentrazioni di saccarosio, mentre le vescicole della membrana interna mitocondriale si arricchiscono ad alte concentrazioni di saccarosio. Le vescicole contenenti i siti di contatto si concentrano a concentrazioni intermedie di saccarosio (Figura 2). Il seguente protocollo descrive in dettaglio questo metodo migliorato, che richiede attrezzature, tempo ed energia meno specializzate rispetto al nostro^{precedente 32}, e fornisce uno strumento utile per l’identificazione di possibili proteine del sito di contatto.

Protocol

1. Tamponi e soluzioni madre Preparare una soluzione di acido 1 M di acido 3-morfolinopropano-1-solfonico (MOPS) in acqua deionizzata, pH 7,4. Conservare a 4 °C. Preparare 500 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in acqua deionizzata, pH 8,0. Conservare a temperatura ambiente. Preparare il sorbitolo 2,4 M in acqua deionizzata. Conservare a temperatura ambiente dopo la sterilizzazione in autoclave. Preparare il saccarosio 2,5 M in acqua deionizzata. Conser…

Representative Results

È relativamente facile separare le membrane mitocondriali interne ed esterne. Tuttavia, la generazione e la separazione delle vescicole contenenti il sito di contatto sono molto più difficili. A nostro avviso, due passaggi sono critici ed essenziali: le condizioni di sonicazione e il gradiente utilizzato. Di solito, si pensa che i gradienti lineari abbiano una risoluzione migliore rispetto ai gradienti a gradini. Tuttavia, la loro produzione riproducibile è noiosa e richiede attrezzature sp…

Discussion

Il frazionamento mitocondriale è un esperimento complicato con diverse fasi molto complesse. Pertanto, abbiamo mirato a migliorare ulteriormente e, in una certa misura, semplificare il nostro metodo^{consolidato 32}. In questo caso, le sfide erano la necessità di attrezzature complicate e altamente specializzate, che spesso sono costruzioni individuali, e l’enorme consumo di tempo ed energia. A tal fine, abbiamo cercato di rimuovere le pompe e le singole costruzioni utilizzate per la colata e la ra…

Materials

13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm	Beckman Instruments, Germany	344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm	Beckman Instruments, Germany	363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g	Beckman Instruments, Germany	363055
Abbe refractometer	Zeiss, Germany		discontinued, any pipet controller will suffice
accu-jet pro Pipet Controller	Brandtech, USA	BR26320	discontinued, any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mL	DWK Life Science, Germany	C118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 D	Branson Ultrasonics, USA	FIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP	Branson Ultrasonics, USA	101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell	Branson Ultrasonics, USA	15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26	Beckman Instruments, Germany	B37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultra	Beckman Instruments, Germany	8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail	Roche, Switzerland	11697498001
D-Sorbit	Roth, Germany	6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)	Roth, Germany	8043
Erlenmeyer flask, 100 mL	Roth, Germany	X747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1	Hirschmann, Germany	1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05	Hirschmann, Germany	1180153
ice bath	neoLab, Germany	S12651
Magnetic stirrer RCT basic	IKA-Werke GmbH, Germany	Z645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)	Gerbu, Germany	1081
MyPipetman Select P1000	Gilson, USA	FP10006S
MyPipetman Select P20	Gilson, USA	FP10003S
MyPipetman Select P200	Gilson, USA	FP10005S
Omnifix 1 mL	Braun, Germany	4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Serva, Germany	32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8×120 mm	Braun, Germany	4022495052414
stirring bar, 15 mm	VWR, USA	442-0366
Sucrose	Merck, Germany	S8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Instruments, Germany	331362
Test tubes	Eppendorf, Germany	3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel	VWR, USA	432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip	VWR, USA	432-0212
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma Aldrich, Germany	33731	discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRIS	Roth, Germany	4855