Een verbeterde methode om mitochondriale contactplaatsen te isoleren
Summary
Mitochondriale contactplaatsen zijn eiwitcomplexen die interageren met mitochondriale binnen- en buitenmembraaneiwitten. Deze plaatsen zijn essentieel voor de communicatie tussen de mitochondriale membranen en dus tussen het cytosol en de mitochondriale matrix. Hier beschrijven we een methode om kandidaten te identificeren die in aanmerking komen voor deze specifieke klasse van eiwitten.
Abstract
Mitochondriën zijn aanwezig in vrijwel alle eukaryote cellen en vervullen essentiële functies die veel verder gaan dan energieproductie, bijvoorbeeld de synthese van ijzer-zwavelclusters, lipiden of eiwitten, Ca2+ -buffering en de inductie van apoptose. Evenzo resulteert mitochondriale disfunctie in ernstige ziekten bij de mens, zoals kanker, diabetes en neurodegeneratie. Om deze functies uit te voeren, moeten mitochondriën communiceren met de rest van de cel over hun omhulsel, dat uit twee membranen bestaat. Daarom moeten deze twee membranen constant op elkaar inwerken. Eiwitachtige contactplaatsen tussen de mitochondriale binnen- en buitenmembranen zijn in dit opzicht essentieel. Tot nu toe zijn er verschillende contactlocaties geïdentificeerd. In de hier beschreven methode worden Saccharomyces cerevisiae-mitochondriën gebruikt om contactplaatsen te isoleren en zo kandidaten te identificeren die in aanmerking komen voor contactplaatseiwitten. We gebruikten deze methode om het mitochondriale contactplaats en cristae organizing system (MICOS) -complex te identificeren, een van de belangrijkste contactplaatsvormende complexen in het mitochondriale binnenmembraan, dat wordt geconserveerd van gist tot mens. Onlangs hebben we deze methode verder verbeterd om een nieuwe contactplaats te identificeren die bestaat uit Cqd1 en het Por1-Om14-complex.
Introduction
Mitochondriën vervullen verschillende functies in eukaryoten, waarvan de meest bekende de productie van ATP door oxidatieve fosforylering is. Andere functies zijn onder meer de productie van ijzer-zwavelclusters, lipidensynthese en in hogere eukaryoten, Ca2+-signalering en de inductie van apoptose 1,2,3,4. Deze functies zijn onlosmakelijk verbonden met hun complexe ultrastructuur.
De mitochondriale ultrastructuur werd voor het eerst beschreven door elektronenmicroscopie5. Er werd aangetoond dat mitochondriën vrij complexe organellen zijn die uit twee membranen bestaan: het mitochondriale buitenmembraan en het mitochondriale binnenmembraan. Door deze membranen worden dus twee waterige compartimenten gevormd: de intermembraanruimte en de matrix. Het mitochondriale binnenmembraan kan nog verder worden onderverdeeld in verschillende secties. Het binnenste grensmembraan blijft in de nabijheid van het buitenste membraan en de cristae vormen invaginaties. Zogenaamde crista-juncties verbinden het binnenste grensmembraan en de cristae (Figuur 1). Bovendien onthullen elektronenmicrofoto’s van osmotisch gekrompen mitochondriën dat er plaatsen bestaan waar de mitochondriale membranen nauw met elkaar verbonden zijn 6,7. Deze zogenaamde contactplaatsen worden gevormd door eiwitcomplexen die de twee membranen overspannen (Figuur 1). Er wordt gedacht dat deze interactieplaatsen essentieel zijn voor de levensvatbaarheid van cellen vanwege hun belang voor de regulatie van mitochondriale dynamiek en overerving, evenals de overdracht van metabolieten en signalen tussen het cytosol en de matrix8.
Het MICOS-complex in het mitochondriale binnenmembraan is waarschijnlijk het best gekarakteriseerde en het meest veelzijdige contactplaatsvormende complex. MICOS werd in 2011 beschreven in gist en bestaat uit zes subeenheden 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 en Mic10. Deze vormen een complex van ongeveer 1,5 MDa dat zich lokaliseert op de crista-knooppunten 9,10,11. Het verwijderen van een van beide kernsubeenheden, Mic10 of Mic60, leidt tot de afwezigheid van dit complex 9,11, wat betekent dat deze twee subeenheden essentieel zijn voor de stabiliteit van MICOS. Interessant is dat MICOS niet slechts één, maar meerdere contactplaatsen vormt met verschillende mitochondriale buitenmembraaneiwitten en -complexen: het TOM-complex 11,12, het TOB/SAM-complex 9,12,13,14,15,16, het Fzo1-Ugo1-complex9,Por1 10, OM45 10 en Miro 17. Dit wijst er sterk op dat het MICOS-complex betrokken is bij verschillende mitochondriale processen, zoals eiwitimport, fosfolipidenmetabolisme en de vorming van de mitochondriale ultrastructuur18. De laatste functie is waarschijnlijk de belangrijkste functie van MICOS, aangezien de afwezigheid van het MICOS-complex geïnduceerd door de deletie van MIC10 of MIC60 leidt tot een abnormale mitochondriale ultrastructuur die vrijwel volledig geen regelmatige cristae heeft. In plaats daarvan hopen interne membraanblaasjes zonder verbinding met het binnenste grensmembraanzich op 19, 20. Belangrijk is dat MICOS in vorm en functie geconserveerd blijft van gist tot mens21. De associatie van mutaties in MICOS-subeenheden met ernstige ziekten bij de mens benadrukt ook het belang ervan voor hogere eukaryoten22,23. Hoewel MICOS zeer veelzijdig is, moeten er extra contactsites zijn (op basis van onze niet-gepubliceerde observaties). Er zijn inderdaad verschillende andere contactplaatsen geïdentificeerd, bijvoorbeeld de mitochondriale fusiemachines Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 of Mdm31-Por1, die betrokken zijn bij de biosynthese van het mitochondriaal-specifieke fosfolipide cardiolipine 27. Onlangs hebben we de methode verbeterd die ons heeft geleid tot de identificatie van MICOS om Cqd1 te identificeren als onderdeel van een nieuwe contactplaats gevormd met het buitenste membraancomplex Por1-Om1428. Interessant is dat deze contactplaats ook betrokken lijkt te zijn bij meerdere processen, zoals de homeostase van het mitochondriale membraan, het fosfolipidenmetabolisme en de distributie van co-enzym Q28,29.
Hier gebruikten we een variatie op de eerder beschreven fractionering van mitochondriën 9,30,31,32,33. Osmotische behandeling van mitochondriën leidt tot de verstoring van het mitochondriale buitenmembraan en tot een krimp van de matrixruimte, waardoor de twee membranen alleen dicht bij elkaar blijven op contactplaatsen. Dit maakt het mogelijk om blaasjes te genereren die uitsluitend bestaan uit mitochondriaal buitenmembraan of mitochondriaal binnenmembraan of op contactplaatsen van beide membranen door middel van milde sonicatie. Omdat het mitochondriale binnenmembraan een veel hogere eiwit-lipideverhouding heeft, vertonen mitochondriale binnenmembraanblaasjes een hogere dichtheid in vergelijking met mitochondriale buitenmembraanblaasjes. Het verschil in dichtheid kan worden gebruikt om de membraanblaasjes te scheiden door middel van sucrose opwaartse dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Zo hopen de mitochondriale buitenste membraanblaasjes zich op bij lage sucroseconcentraties, terwijl de mitochondriale binnenmembraanblaasjes worden verrijkt bij hoge sucroseconcentraties. De blaasjes die contactplaatsen bevatten, concentreren zich op intermediaire sacharoseconcentraties (figuur 2). Het volgende protocol beschrijft deze verbeterde methode, die minder gespecialiseerde apparatuur, tijd en energie vereist in vergelijking met onze eerder vastgestelde32, in detail en biedt een nuttig hulpmiddel voor de identificatie van mogelijke contactplaatseiwitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitochondriale subfractionering is een ingewikkeld experiment met verschillende zeer complexe stappen. Daarom hebben we ernaar gestreefd om onze gevestigde methode verder te verbeteren en, tot op zekere hoogte, te vereenvoudigen32. Hier waren de uitdagingen de behoefte aan gecompliceerde en zeer gespecialiseerde apparatuur, die vaak individuele constructies zijn, en het enorme tijd- en energieverbruik. Daartoe hebben we geprobeerd de pompen en individuele constructies die worden gebruikt voor het …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.E.H. erkent de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projectnummer 413985647, voor financiële steun. De auteurs danken Dr. Michael Kiebler, Ludwig-Maximilians Universiteit, München, voor zijn genereuze en uitgebreide steun. We zijn Walter Neupert dankbaar voor zijn wetenschappelijke inbreng, nuttige discussies en voortdurende inspiratie. J.F. bedankt de Graduate School Life Science Munich (LSM) voor de steun.
Materials
| 13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm | Beckman Instruments, Germany | 344059 | |
| 50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm | Beckman Instruments, Germany | 363647 | |
| A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g | Beckman Instruments, Germany | 363055 | |
| Abbe refractometer | Zeiss, Germany | discontinued, any pipet controller will suffice |
|
| accu-jet pro Pipet Controller | Brandtech, USA | BR26320 | discontinued, any pipet controller will suffice |
| Beaker 1000 mL | DWK Life Science, Germany | C118.1 | |
| Branson Digital Sonifier W-250 D | Branson Ultrasonics, USA | FIS15-338-125 | |
| Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP | Branson Ultrasonics, USA | 101-148-062 | |
| Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell | Branson Ultrasonics, USA | 15-338-70 | |
| Centrifuge Avanti JXN-26 | Beckman Instruments, Germany | B37912 | |
| Centrifuge Optima XPN-100 ultra | Beckman Instruments, Germany | 8043-30-0031 | |
| cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail | Roche, Switzerland | 11697498001 | |
| D-Sorbit | Roth, Germany | 6213 | |
| EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Roth, Germany | 8043 | |
| Erlenmeyer flask, 100 mL | Roth, Germany | X747.1 | |
| graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 | Hirschmann, Germany | 1180170 | |
| graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 | Hirschmann, Germany | 1180153 | |
| ice bath | neoLab, Germany | S12651 | |
| Magnetic stirrer RCT basic | IKA-Werke GmbH, Germany | Z645060GB-1EA | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) | Gerbu, Germany | 1081 | |
| MyPipetman Select P1000 | Gilson, USA | FP10006S | |
| MyPipetman Select P20 | Gilson, USA | FP10003S | |
| MyPipetman Select P200 | Gilson, USA | FP10005S | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Germany | 4022495251879 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Serva, Germany | 32395.03 | |
| STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8×120 mm | Braun, Germany | 4022495052414 | |
| stirring bar, 15 mm | VWR, USA | 442-0366 | |
| Sucrose | Merck, Germany | S8501 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Instruments, Germany | 331362 | |
| Test tubes | Eppendorf, Germany | 3810X | |
| Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel | VWR, USA | 432-0200 | |
| Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip | VWR, USA | 432-0212 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma Aldrich, Germany | 33731 | discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9) |
| TRIS | Roth, Germany | 4855 |
References
- Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA – Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863 (2021).
- Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T. Prohibitins and the functional compartmentalization of mitochondrial membranes. Journal of Cell Science. 122 (21), 3823-3830 (2009).
- Smaili, S. S., Hsu, Y., Youle, R. J., Russell, J. T. Mitochondria in Ca 2 %. Signaling and Apoptosis. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 32 (1), (2000).
- Rolland, S. G., Conradt, B. New role of the BCL2 family of proteins in the regulation of mitochondrial dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 22 (6), 852-858 (2011).
- Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The journal of histochemistry and cytochemistry: official journal of the Histochemistry Society. 1 (4), 188-211 (1953).
- Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of cell biology. 30 (2), 269-297 (1966).
- Hackenbrock, C. R. Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 598-605 (1968).
- Reichert, A. S., Neupert, W. Contact sites between the outer and inner membrane of mitochondria – Role in protein transport. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1592 (1), 41-49 (2002).
- Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO Journal. 30 (21), 4356-4370 (2011).
- Hoppins, S., et al. A mitochondrial-focused genetic interaction map reveals a scaffold-like complex required for inner membrane organization in mitochondria. Journal of Cell Biology. 195 (2), 323-340 (2011).
- vonder Malsburg, K., et al. Dual Role of Mitofilin in Mitochondrial Membrane Organization and Protein Biogenesis. Developmental Cell. 21 (4), 694-707 (2011).
- Bohnert, M., et al. Role of mitochondrial inner membrane organizing system in protein biogenesis of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 23 (20), 3948-3956 (2012).
- Darshi, M., et al. ChChd3, an inner mitochondrial membrane protein, is essential for maintaining Crista integrity and mitochondrial function. Journal of Biological Chemistry. 286 (4), 2918-2932 (2011).
- Körner, C., et al. The C-terminal domain of Fcj1 is required for formation of crista junctions and interacts with the TOB/SAM complex in mitochondria. Molecular Biology of the Cell. 23 (11), 2143-2155 (2012).
- Xie, J., Marusich, M. F., Souda, P., Whitelegge, J., Capaldi, R. A. The mitochondrial inner membrane protein Mitofilin exists as a complex with SAM50, metaxins 1 and 2, coiled-coil-helix coiled-coil-helix domain-containing protein 3 and 6 and DnaJC11. FEBS Letters. 581 (18), 3545-3549 (2007).
- Zerbes, R. M., et al. Role of MINOS in mitochondrial membrane architecture: Cristae morphology and outer membrane interactions differentially depend on mitofilin domains. Journal of Molecular Biology. 422 (2), 183-191 (2012).
- Modi, S., et al. Miro clusters regulate ER-mitochondria contact sites and link cristae organization to the mitochondrial transport machinery. Nature Communications. 10 (1), 4399 (2019).
- Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
- John, G. B., et al. The mitochondrial inner membrane protein mitofilin controls cristae morphology. Molecular Biology of the Cell. 16 (3), 1543-1554 (2005).
- Rabl, R., et al. Formation of cristae and crista junctions in mitochondria depends on antagonism between Fcj1 and Su e/g. Journal of Cell Biology. 185 (6), 1047-1063 (2009).
- Alkhaja, A. K., et al. MINOS1 is a conserved component of mitofilin complexes and required for mitochondrial function and cristae organization. Molecular Biology of the Cell. 23 (2), 247-257 (2012).
- Eramo, M. J., Lisnyak, V., Formosa, L. E., Ryan, M. T. The "mitochondrial contact site and cristae organising system" (MICOS) in health and human disease. Journal of Biochemistry. 167 (3), 243-255 (2020).
- Ikeda, A., Imai, Y., Hattori, N. Neurodegeneration-associated mitochondrial proteins, CHCHD2 and CHCHD10-what distinguishes the two. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1-12 (2022).
- Sesaki, H., Southard, S. M., Yaffe, M. P., Jensen, R. E. Mgm1p, a dynamin-related GTPase, is essential for fusion of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 14 (6), 2342-2356 (2003).
- Fritz, S., Rapaport, D., Klanner, E., Neupert, W., Westermann, B. Connection of the mitochondrial outer and inner membranes by Fzo1 is critical for organellar fusion. Journal of Cell Biology. 152 (4), 683-692 (2001).
- Wong, E. D., et al. The intramitochondrial dynamin-related GTPase, Mgm1p, is a component of a protein complex that mediates mitochondrial fusion. Journal of Cell Biology. 160 (3), 303-311 (2003).
- Miyata, N., Fujii, S., Kuge, O. Porin proteins have critical functions in mitochondrial phospholipid metabolism in yeast. Journal of Biological Chemistry. 293 (45), 17593-17605 (2018).
- Khosravi, S., et al. The UbiB family member Cqd1 forms a novel membrane contact site in mitochondria. J Cell Sci. , (2023).
- Kemmerer, Z. A., et al. UbiB proteins regulate cellular CoQ distribution in Saccharomyces cerevisiae. Nature Communications. 12 (1), 4769 (2021).
- Pon, L., Moll, T., Vestweber, D., Marshallsay, B., Schatz, G. Protein import into mitochondria: ATP-dependent protein translocation activity in a submitochondrial fraction enriched in membrane contact sites and specific proteins. Journal of Cell Biology. 109, 2603-2616 (1989).
- Lithgow, T., Timms, M., Hj, P. B., Hoogenraad, N. J. Identification of a GTP-binding protein in the contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 180 (3), 1453-1459 (1991).
- Harner, M. Isolation of contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Methods in Molecular Biology. 1567, 43-51 (2017).
- Adams, V., Bosch, W., Schlegel, J., Wallimann, T., Brdiczka, D. Further characterization of contact sites from mitochondria of different tissues: topology of peripheral kinases. BBA – Biomembranes. 981 (2), 213-225 (1989).
- Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1567, 33-42 (2017).
- Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments. (30), 17-19 (2009).
- Beavis, A. D., Brannan, R. D., Garlid, K. D. Swelling and Contraction of the Mitochondrial Matrix I. A structural interpretation of the relationship between light scattering and matrix volume. Journal of Biological Chemistry. 260 (25), 13424-13433 (1985).
- Born, M., Wolf, E. . Principles of optics electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , (1999).
- Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
- Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: A method for studying antibody specificity and antigen structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3116-3120 (1979).
- Al-Tubuly, A. A. SDS-PAGE and Western Blotting. Methods Mol Med. 40, 391-405 (2000).
- Kurien, B. T., Hal Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. Western Blotting: Methods and Protocols. (3), 1 (2015).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. (16), (2008).
- Sherman, F. Getting Started with Yeast. Methods in Enzymology. 194, 3-21 (1991).
- Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comparative and Functional Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
- Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: More tags and improved practical routines. Yeast. 15, 963-972 (1999).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tsai, P. I., et al. PINK1 Phosphorylates MIC60/Mitofilin to Control Structural Plasticity of Mitochondrial Crista Junctions. Molecular Cell. 69 (5), 744-756 (2018).
- Xiao, T., et al. Identification of CHCHD10 Mutation in Chinese Patients with Alzheimer Disease. Molecular Neurobiology. 54 (7), 5243-5247 (2017).
- Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
- Chaussenot, A., et al. Screening of CHCHD10 in a French cohort confirms the involvement of this gene in frontotemporal dementia with amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 35 (12), 1-4 (2014).
- Chiò, A., et al. CHCH10 mutations in an Italian cohort of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 36 (4), 3-6 (2015).
- Genin, E. C., et al. CHCHD 10 mutations promote loss of mitochondrial cristae junctions with impaired mitochondrial genome maintenance and inhibition of apoptosis. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 58-72 (2016).
- Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
