ミトコンドリア接触部位を単離するための改良された方法
Summary
ミトコンドリアコンタクトサイトは、ミトコンドリアの内膜および外膜タンパク質と相互作用するタンパク質複合体です。これらの部位は、ミトコンドリア膜間のコミュニケーション、したがって細胞質とミトコンドリアマトリックスの間のコミュニケーションに不可欠です。ここでは、この特定のクラスのタンパク質に適格な候補を同定する方法について説明します。
Abstract
ミトコンドリアは、事実上すべての真核細胞に存在し、例えば、鉄硫黄クラスター、脂質、またはタンパク質の合成、Ca2+ 緩衝、およびアポトーシスの誘導など、エネルギー生産をはるかに超える重要な機能を果たします。同様に、ミトコンドリアの機能不全は、癌、糖尿病、神経変性などの重篤な人間の病気を引き起こします。これらの機能を実行するために、ミトコンドリアは、2つの膜からなるエンベロープを介して細胞の残りの部分と通信する必要があります。したがって、これら2つの膜は常に相互作用する必要があります。ミトコンドリアの内膜と外膜の間のタンパク質接触部位は、この点で不可欠です。これまでのところ、いくつかの接触サイトが特定されています。本明細書に記載の方法では、 出芽酵母ミトコンドリア(Saccharomyces cerevisiae mitochondria)を用いて接触部位を単離し、したがって、接触部位タンパク質に適格な候補を同定する。この手法を用いて、酵母からヒトまで保存されているミトコンドリア内膜における主要なコンタクトサイト形成複合体の1つであるミトコンドリアコンタクトサイトとクリステ組織システム(MICOS)複合体を同定しました。最近では、この手法をさらに改良し、Cqd1とPor1-Om14複合体からなる新規コンタクトサイトを同定しました。
Introduction
ミトコンドリアは真核生物においてさまざまな機能を果たしており、最もよく知られているのは酸化的リン酸化によるATPの産生です。その他の機能には、鉄-硫黄クラスターの生成、脂質合成、および高等真核生物ではCa2+シグナル伝達、およびアポトーシスの誘導が含まれます1,2,3,4。これらの機能は、その複雑な超微細構造と不可分に結びついています。
ミトコンドリアの超微細構造は、電子顕微鏡5によって最初に記述された。ミトコンドリアは、ミトコンドリア外膜とミトコンドリア内膜の2つの膜からなるかなり複雑な細胞小器官であることが示されました。したがって、2つの水性区画がこれらの膜によって形成される:膜間空間およびマトリックス。ミトコンドリアの内膜は、さらに異なるセクションに分けることができます。内側の境界膜は外側の膜に近接しており、クリステは陥入を形成します。いわゆるクリスタ接合部は、内側の境界膜とクリステをつなぎます(図1)。さらに、浸透圧的に縮小したミトコンドリアの電子顕微鏡写真は、ミトコンドリア膜が緊密に結合している部位が存在することを明らかにした6,7。これらのいわゆるコンタクトサイトは、2つの膜にまたがるタンパク質複合体によって形成されます(図1)。これらの相互作用部位は、ミトコンドリアの動態と遺伝の調節、ならびに細胞質とマトリックスの間の代謝産物とシグナルの伝達にとって重要であるため、細胞の生存に不可欠であると考えられている8。
ミトコンドリア内膜のMICOS複合体は、おそらく最もよく特徴付けられ、最も用途の広いコンタクトサイト形成複合体です。MICOSは2011年に酵母で記載され、Mic60、Mic27、Mic26、Mic19、Mic12、Mic10の6つのサブユニット9,10,1で構成されています。これらは約1.5MDaの複合体を形成し、クリスタ接合部9,10,11に局在する。Mic10またはMic60のいずれかのコアサブユニットが欠失すると、この複合体が欠損する9,11ため、これら2つのサブユニットがMICOSの安定性に不可欠である。興味深いことに、MICOSは、TOM複合体11,12、TOB/SAM複合体9,12,13,14,15,16、Fzo1-Ugo1複合体9、Por1 10、OM45 10、Miro 17など、様々なミトコンドリア外膜タンパク質および複合体と1つだけでなく複数の接触部位を形成します.このことは、MICOS複合体が、タンパク質の取り込み、リン脂質代謝、ミトコンドリアの超微細構造の生成など、様々なミトコンドリアプロセスに関与していることを強く示唆している18。後者の機能は、MIC10またはMIC60の欠失によって誘導されるMICOS複合体の欠如が、事実上完全に規則的なクリステを欠く異常なミトコンドリアの超微細構造をもたらすため、おそらくMICOSの主要な機能である。その代わりに、内界膜と接続していない内膜小胞が蓄積する19、20。重要なことに、MICOSは酵母からヒトまで形態と機能が保存されています21。MICOSサブユニットの変異と重篤なヒト疾患との関連は、高等真核生物にとっての重要性も強調している22,23。MICOSは非常に用途が広いですが、追加の接触サイトが存在する必要があります(未発表の観察に基づく)。実際、ミトコンドリア特異的リン脂質カルジオリピンの生合成に関与するミトコンドリア融合機構Mgm1-Ugo1/Fzo124,25,26またはMdm31-Por1など、他のいくつかの接触部位が同定されている27。最近、我々はMICOSの同定に至った手法を改良し、外膜複合体Por1-Om14と形成される新規接触部位の一部としてCqd1を同定した28。興味深いことに、この接触部位は、ミトコンドリア膜の恒常性、リン脂質代謝、コエンザイムQ28,29の分布などの複数のプロセスにも関与しているようです。
ここでは、先に述べたミトコンドリア9,30,31,32,33の分画の変形を用いた。ミトコンドリアの浸透圧処理は、ミトコンドリア外膜の破壊とマトリックス空間の収縮をもたらし、2つの膜は接触部位でのみ近接した状態になります。これにより、ミトコンドリア外膜またはミトコンドリア内膜のみからなる、または軽度の超音波処理による両方の膜の接触部位を含む小胞の生成が可能になります。ミトコンドリア内膜はタンパク質と脂質の比率がはるかに高いため、ミトコンドリア内膜小胞はミトコンドリア外膜小胞と比較してより高い密度を示します。密度の差を利用して、スクロース浮力密度勾配遠心分離により膜小胞を分離することができます。したがって、ミトコンドリア外膜小胞は低スクロース濃度で蓄積し、ミトコンドリア内膜小胞は高スクロース濃度で濃縮されます。接触部位を含む小胞は、中程度のスクロース濃度で濃縮されます(図2)。以下のプロトコルは、以前に確立されたもの32と比較して、より少ない専門機器、時間、およびエネルギーを必要とするこの改良された方法を詳細に説明し、可能な接触部位タンパク質の同定のための有用なツールを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ミトコンドリアの分画は、いくつかの非常に複雑なステップからなる複雑な実験です。したがって、確立された方法32をさらに改善し、ある程度簡素化することを目指しました。ここでの課題は、複雑で高度に専門化された機器が必要であり、多くの場合、個別の構造であり、膨大な時間とエネルギーを消費することでした。そのために、線状勾配の鋳造と収穫に用いたポ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.E.H.は、Deutsche Forschungsgemeinschaft(DFG)プロジェクト番号413985647の資金援助に感謝します。著者らは、ミュンヘンのルートヴィヒ・マクシミリアン大学のミヒャエル・キーブラー博士の寛大で広範な支援に感謝します。ウォルター・ノイペルト氏の科学的なインプット、有益な議論、そして継続的なインスピレーションに感謝します。J.F.は、ミュンヘン生命科学大学院(LSM)の支援に感謝します。
Materials
| 13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm | Beckman Instruments, Germany | 344059 | |
| 50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm | Beckman Instruments, Germany | 363647 | |
| A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g | Beckman Instruments, Germany | 363055 | |
| Abbe refractometer | Zeiss, Germany | discontinued, any pipet controller will suffice |
|
| accu-jet pro Pipet Controller | Brandtech, USA | BR26320 | discontinued, any pipet controller will suffice |
| Beaker 1000 mL | DWK Life Science, Germany | C118.1 | |
| Branson Digital Sonifier W-250 D | Branson Ultrasonics, USA | FIS15-338-125 | |
| Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP | Branson Ultrasonics, USA | 101-148-062 | |
| Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell | Branson Ultrasonics, USA | 15-338-70 | |
| Centrifuge Avanti JXN-26 | Beckman Instruments, Germany | B37912 | |
| Centrifuge Optima XPN-100 ultra | Beckman Instruments, Germany | 8043-30-0031 | |
| cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail | Roche, Switzerland | 11697498001 | |
| D-Sorbit | Roth, Germany | 6213 | |
| EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Roth, Germany | 8043 | |
| Erlenmeyer flask, 100 mL | Roth, Germany | X747.1 | |
| graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 | Hirschmann, Germany | 1180170 | |
| graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 | Hirschmann, Germany | 1180153 | |
| ice bath | neoLab, Germany | S12651 | |
| Magnetic stirrer RCT basic | IKA-Werke GmbH, Germany | Z645060GB-1EA | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) | Gerbu, Germany | 1081 | |
| MyPipetman Select P1000 | Gilson, USA | FP10006S | |
| MyPipetman Select P20 | Gilson, USA | FP10003S | |
| MyPipetman Select P200 | Gilson, USA | FP10005S | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Germany | 4022495251879 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Serva, Germany | 32395.03 | |
| STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8×120 mm | Braun, Germany | 4022495052414 | |
| stirring bar, 15 mm | VWR, USA | 442-0366 | |
| Sucrose | Merck, Germany | S8501 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Instruments, Germany | 331362 | |
| Test tubes | Eppendorf, Germany | 3810X | |
| Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel | VWR, USA | 432-0200 | |
| Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip | VWR, USA | 432-0212 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma Aldrich, Germany | 33731 | discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9) |
| TRIS | Roth, Germany | 4855 |
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