En forbedret metode for å isolere mitokondrielle kontaktsteder

Summary

Mitokondrielle kontaktsteder er proteinkomplekser som interagerer med mitokondrielle indre og ytre membranproteiner. Disse stedene er avgjørende for kommunikasjonen mellom mitokondriemembranene og dermed mellom cytosol og mitokondriematrisen. Her beskriver vi en metode for å identifisere kandidater som kvalifiserer for denne spesifikke klassen av proteiner.

Abstract

Mitokondrier er tilstede i nesten alle eukaryote celler og utfører viktige funksjoner som går langt utover energiproduksjon, for eksempel syntese av jern-svovelklynger, lipider eller proteiner, Ca^{2 +} buffering og induksjon av apoptose. På samme måte resulterer mitokondriell dysfunksjon i alvorlige menneskelige sykdommer som kreft, diabetes og nevrodegenerasjon. For å utføre disse funksjonene må mitokondrier kommunisere med resten av cellen over konvolutten, som består av to membraner. Derfor må disse to membranene samhandle hele tiden. Proteinholdige kontaktsteder mellom mitokondrielle indre og ytre membraner er avgjørende i denne forbindelse. Så langt er det identifisert flere kontaktsteder. I metoden beskrevet her brukes Saccharomyces cerevisiae mitokondrier til å isolere kontaktsteder og dermed identifisere kandidater som kvalifiserer for kontaktstedproteiner. Vi brukte denne metoden for å identifisere mitokondriekontaktstedet og cristae organiseringssystem (MICOS) -komplekset, et av de viktigste kontaktsteddannende kompleksene i mitokondriell indre membran, som er konservert fra gjær til mennesker. Nylig har vi ytterligere forbedret denne metoden for å identifisere et nytt kontaktsted bestående av Cqd1 og Por1-Om14-komplekset.

Introduction

Mitokondrier utfører en rekke forskjellige funksjoner i eukaryoter, med den mest kjente som produksjon av ATP gjennom oksidativ fosforylering. Andre funksjoner inkluderer produksjon av jern-svovelklynger, lipidsyntese og i høyere eukaryoter, Ca²⁺ signalering og induksjon av apoptose 1,2,3,4. Disse funksjonene er uadskillelig knyttet til deres komplekse ultrastruktur.

Mitokondriell ultrastruktur ble først beskrevet ved elektronmikroskopi⁵. Det ble vist at mitokondrier er ganske komplekse organeller bestående av to membraner: mitokondriell ytre membran og mitokondriell indre membran. Dermed dannes to vandige rom av disse membranene: intermembranrommet og matrisen. Den mitokondrielle indre membranen kan deles enda lenger inn i forskjellige seksjoner. Den indre grensemembranen forblir i nærheten av den ytre membranen, og cristae danner invaginasjoner. Såkalte crista-kryss forbinder indre grensehinne og cristae (figur 1). Videre avslører elektronmikrografer av osmotisk krympede mitokondrier at steder eksisterer hvor mitokondriemembranene er tett forbundet ^6,7. Disse såkalte kontaktstedene dannes av proteinkomplekser som spenner over de to membranene (figur 1). Det antas at disse interaksjonsstedene er avgjørende for cellens levedyktighet på grunn av deres betydning for regulering av mitokondriell dynamikk og arv, samt overføring av metabolitter og signaler mellom cytosol og matrise⁸.

MICOS-komplekset i mitokondriell indre membran er sannsynligvis det best karakteriserte og det mest allsidige kontaktsteddannende komplekset. MICOS ble beskrevet i gjær i 2011, og den består av seks underenheter 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19^, Mic12 og ^Mic10. Disse danner et kompleks på ca. 1,5 MDa som lokaliseres til crista-kryssene 9,10,11. Slettingen av enten kjerneunderenhet, Mic10 eller Mic60, fører til fraværet av denne komplekse ^9,11, noe som betyr at disse to underenhetene er avgjørende for stabiliteten til MICOS. Interessant nok danner MICOS ikke bare ett, men flere kontaktsteder med forskjellige mitokondrielle ytre membranproteiner og komplekser: TOM-komplekset 11,12, TOB/SAM-komplekset 9,12,13,14,15,16, Fzo1-Ugo1-komplekset⁹, Por1 10^, OM45 10 og Miro ¹⁷. Dette indikerer sterkt at MICOS-komplekset er involvert i forskjellige mitokondrielle prosesser, for eksempel proteinimport, fosfolipidmetabolisme og generering av mitokondriell ultrastruktur¹⁸. Sistnevnte funksjon er sannsynligvis den viktigste funksjonen til MICOS, da fraværet av MICOS-komplekset indusert gjennom sletting av MIC10 eller MIC60 fører til en unormal mitokondriell ultrastruktur som nesten helt mangler regelmessig cristae. I stedet akkumuleres indre membranvesikler uten tilkobling til den indre grensemembranen^{19, 20}. Det er viktig at MICOS er bevart i form og funksjon fra gjær til menneske²¹. Assosiasjonen av mutasjoner i MICOS-underenheter med alvorlige menneskelige sykdommer understreker også dens betydning for høyere eukaryoter^22,23. Selv om MICOS er svært allsidig, må det finnes flere kontaktsteder (basert på våre upubliserte observasjoner). Faktisk har flere andre kontaktsteder blitt identifisert, for eksempel mitokondriefusjonsmaskineriene Mgm1-Ugo1 / Fzo1 24,25,26 eller Mdm31-Por1^, som er involvert i biosyntesen av mitokondrie-spesifikk fosfolipidkardiolipin ²⁷. Nylig forbedret vi metoden som førte oss til identifiseringen av MICOS for å identifisere Cqd1 som en del av et nytt kontaktsted dannet med det ytre membrankomplekset Por1-Om14²⁸. Interessant nok synes dette kontaktstedet også å være involvert i flere prosesser som mitokondriemembranhomeostase, fosfolipidmetabolisme og fordelingen av koenzym Q^28,29.

Her brukte vi en variant av den tidligere beskrevne fraksjoneringen av mitokondrier 9,30,31,32,33. Osmotisk behandling av mitokondrier fører til forstyrrelse av mitokondriell ytre membran og til krymping av matriksrommet, og etterlater de to membranene bare i umiddelbar nærhet på kontaktsteder. Dette muliggjør generering av vesikler som utelukkende består av mitokondriell ytre membran eller mitokondriell indre membran eller ved å inneholde kontaktsteder for begge membraner gjennom mild lydbehandling. På grunn av at den mitokondrielle indre membranen har et mye høyere protein-til-lipid-forhold, viser mitokondrielle indre membranvesikler en høyere tetthet sammenlignet med mitokondrielle ytre membranvesikler. Forskjellen i tetthet kan brukes til å skille membranvesiklene gjennom sukrose, oppdrifts, tetthetsgradient, sentrifugering. Dermed akkumuleres mitokondrielle ytre membranvesikler ved lave sukrosekonsentrasjoner, mens mitokondrielle indre membranvesikler er anriket ved høye sukrosekonsentrasjoner. Vesiklene som inneholder kontaktstedene, konsentrerer seg i middels sukrosekonsentrasjoner (figur 2). Følgende protokoll beskriver denne forbedrede metoden, som krever mindre spesialisert utstyr, tid og energi sammenlignet med vår tidligere etablerte³², i detalj og gir et nyttig verktøy for identifisering av mulige kontaktstedproteiner.

Protocol

1. Buffere og lagerløsninger Lag en 1 M 3-morfolinopropan-1-sulfonsyre (MOPS) løsning i avionisert vann, pH 7,4. Oppbevares ved 4 °C. Forbered 500 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i avionisert vann, pH 8,0. Oppbevares i romtemperatur. Forbered 2,4 M sorbitol i avionisert vann. Oppbevares i romtemperatur etter autoklavering. Forbered 2,5 M sukrose i avionisert vann. Oppbevares i romtemperatur etter autoklavering. Tilbered 200 mM fenylmetylsulfonylfl…

Representative Results

Det er relativt enkelt å skille mitokondrielle indre og ytre membraner. Imidlertid er generering og separasjon av kontaktstedholdige vesikler mye vanskeligere. Etter vår mening er to trinn kritiske og essensielle: sonikeringsforholdene og gradienten som brukes. Vanligvis antas lineære gradienter å ha en bedre oppløsning sammenlignet med trinngradienter. Imidlertid er deres reproduserbare produksjon kjedelig og krever spesialutstyr. Derfor etablerte vi en metode for å generere en trinngra…

Discussion

Mitokondriell subfraksjonering er et komplisert eksperiment med flere svært komplekse trinn. Derfor ønsket vi å ytterligere forbedre og til en viss grad forenkle vår etablerte metode³². Her var utfordringene kravet til komplisert og høyt spesialisert utstyr, som ofte er enkeltkonstruksjoner, og det enorme tids- og energiforbruket. Til dette formål prøvde vi å fjerne pumpene og individuelle konstruksjoner som ble brukt til støping og høsting av den lineære gradienten og endret til en tri…

Materials

13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm	Beckman Instruments, Germany	344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm	Beckman Instruments, Germany	363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g	Beckman Instruments, Germany	363055
Abbe refractometer	Zeiss, Germany		discontinued, any pipet controller will suffice
accu-jet pro Pipet Controller	Brandtech, USA	BR26320	discontinued, any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mL	DWK Life Science, Germany	C118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 D	Branson Ultrasonics, USA	FIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP	Branson Ultrasonics, USA	101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell	Branson Ultrasonics, USA	15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26	Beckman Instruments, Germany	B37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultra	Beckman Instruments, Germany	8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail	Roche, Switzerland	11697498001
D-Sorbit	Roth, Germany	6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)	Roth, Germany	8043
Erlenmeyer flask, 100 mL	Roth, Germany	X747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1	Hirschmann, Germany	1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05	Hirschmann, Germany	1180153
ice bath	neoLab, Germany	S12651
Magnetic stirrer RCT basic	IKA-Werke GmbH, Germany	Z645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)	Gerbu, Germany	1081
MyPipetman Select P1000	Gilson, USA	FP10006S
MyPipetman Select P20	Gilson, USA	FP10003S
MyPipetman Select P200	Gilson, USA	FP10005S
Omnifix 1 mL	Braun, Germany	4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Serva, Germany	32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8×120 mm	Braun, Germany	4022495052414
stirring bar, 15 mm	VWR, USA	442-0366
Sucrose	Merck, Germany	S8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Instruments, Germany	331362
Test tubes	Eppendorf, Germany	3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel	VWR, USA	432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip	VWR, USA	432-0212
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma Aldrich, Germany	33731	discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRIS	Roth, Germany	4855