Mitokondrielle kontaktsteder er proteinkomplekser som interagerer med mitokondrielle indre og ytre membranproteiner. Disse stedene er avgjørende for kommunikasjonen mellom mitokondriemembranene og dermed mellom cytosol og mitokondriematrisen. Her beskriver vi en metode for å identifisere kandidater som kvalifiserer for denne spesifikke klassen av proteiner.
Mitokondrier er tilstede i nesten alle eukaryote celler og utfører viktige funksjoner som går langt utover energiproduksjon, for eksempel syntese av jern-svovelklynger, lipider eller proteiner, Ca2 + buffering og induksjon av apoptose. På samme måte resulterer mitokondriell dysfunksjon i alvorlige menneskelige sykdommer som kreft, diabetes og nevrodegenerasjon. For å utføre disse funksjonene må mitokondrier kommunisere med resten av cellen over konvolutten, som består av to membraner. Derfor må disse to membranene samhandle hele tiden. Proteinholdige kontaktsteder mellom mitokondrielle indre og ytre membraner er avgjørende i denne forbindelse. Så langt er det identifisert flere kontaktsteder. I metoden beskrevet her brukes Saccharomyces cerevisiae mitokondrier til å isolere kontaktsteder og dermed identifisere kandidater som kvalifiserer for kontaktstedproteiner. Vi brukte denne metoden for å identifisere mitokondriekontaktstedet og cristae organiseringssystem (MICOS) -komplekset, et av de viktigste kontaktsteddannende kompleksene i mitokondriell indre membran, som er konservert fra gjær til mennesker. Nylig har vi ytterligere forbedret denne metoden for å identifisere et nytt kontaktsted bestående av Cqd1 og Por1-Om14-komplekset.
Mitokondrier utfører en rekke forskjellige funksjoner i eukaryoter, med den mest kjente som produksjon av ATP gjennom oksidativ fosforylering. Andre funksjoner inkluderer produksjon av jern-svovelklynger, lipidsyntese og i høyere eukaryoter, Ca2+ signalering og induksjon av apoptose 1,2,3,4. Disse funksjonene er uadskillelig knyttet til deres komplekse ultrastruktur.
Mitokondriell ultrastruktur ble først beskrevet ved elektronmikroskopi5. Det ble vist at mitokondrier er ganske komplekse organeller bestående av to membraner: mitokondriell ytre membran og mitokondriell indre membran. Dermed dannes to vandige rom av disse membranene: intermembranrommet og matrisen. Den mitokondrielle indre membranen kan deles enda lenger inn i forskjellige seksjoner. Den indre grensemembranen forblir i nærheten av den ytre membranen, og cristae danner invaginasjoner. Såkalte crista-kryss forbinder indre grensehinne og cristae (figur 1). Videre avslører elektronmikrografer av osmotisk krympede mitokondrier at steder eksisterer hvor mitokondriemembranene er tett forbundet 6,7. Disse såkalte kontaktstedene dannes av proteinkomplekser som spenner over de to membranene (figur 1). Det antas at disse interaksjonsstedene er avgjørende for cellens levedyktighet på grunn av deres betydning for regulering av mitokondriell dynamikk og arv, samt overføring av metabolitter og signaler mellom cytosol og matrise8.
MICOS-komplekset i mitokondriell indre membran er sannsynligvis det best karakteriserte og det mest allsidige kontaktsteddannende komplekset. MICOS ble beskrevet i gjær i 2011, og den består av seks underenheter 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 og Mic10. Disse danner et kompleks på ca. 1,5 MDa som lokaliseres til crista-kryssene 9,10,11. Slettingen av enten kjerneunderenhet, Mic10 eller Mic60, fører til fraværet av denne komplekse 9,11, noe som betyr at disse to underenhetene er avgjørende for stabiliteten til MICOS. Interessant nok danner MICOS ikke bare ett, men flere kontaktsteder med forskjellige mitokondrielle ytre membranproteiner og komplekser: TOM-komplekset 11,12, TOB/SAM-komplekset 9,12,13,14,15,16, Fzo1-Ugo1-komplekset9, Por1 10, OM45 10 og Miro 17. Dette indikerer sterkt at MICOS-komplekset er involvert i forskjellige mitokondrielle prosesser, for eksempel proteinimport, fosfolipidmetabolisme og generering av mitokondriell ultrastruktur18. Sistnevnte funksjon er sannsynligvis den viktigste funksjonen til MICOS, da fraværet av MICOS-komplekset indusert gjennom sletting av MIC10 eller MIC60 fører til en unormal mitokondriell ultrastruktur som nesten helt mangler regelmessig cristae. I stedet akkumuleres indre membranvesikler uten tilkobling til den indre grensemembranen19, 20. Det er viktig at MICOS er bevart i form og funksjon fra gjær til menneske21. Assosiasjonen av mutasjoner i MICOS-underenheter med alvorlige menneskelige sykdommer understreker også dens betydning for høyere eukaryoter22,23. Selv om MICOS er svært allsidig, må det finnes flere kontaktsteder (basert på våre upubliserte observasjoner). Faktisk har flere andre kontaktsteder blitt identifisert, for eksempel mitokondriefusjonsmaskineriene Mgm1-Ugo1 / Fzo1 24,25,26 eller Mdm31-Por1, som er involvert i biosyntesen av mitokondrie-spesifikk fosfolipidkardiolipin 27. Nylig forbedret vi metoden som førte oss til identifiseringen av MICOS for å identifisere Cqd1 som en del av et nytt kontaktsted dannet med det ytre membrankomplekset Por1-Om1428. Interessant nok synes dette kontaktstedet også å være involvert i flere prosesser som mitokondriemembranhomeostase, fosfolipidmetabolisme og fordelingen av koenzym Q28,29.
Her brukte vi en variant av den tidligere beskrevne fraksjoneringen av mitokondrier 9,30,31,32,33. Osmotisk behandling av mitokondrier fører til forstyrrelse av mitokondriell ytre membran og til krymping av matriksrommet, og etterlater de to membranene bare i umiddelbar nærhet på kontaktsteder. Dette muliggjør generering av vesikler som utelukkende består av mitokondriell ytre membran eller mitokondriell indre membran eller ved å inneholde kontaktsteder for begge membraner gjennom mild lydbehandling. På grunn av at den mitokondrielle indre membranen har et mye høyere protein-til-lipid-forhold, viser mitokondrielle indre membranvesikler en høyere tetthet sammenlignet med mitokondrielle ytre membranvesikler. Forskjellen i tetthet kan brukes til å skille membranvesiklene gjennom sukrose, oppdrifts, tetthetsgradient, sentrifugering. Dermed akkumuleres mitokondrielle ytre membranvesikler ved lave sukrosekonsentrasjoner, mens mitokondrielle indre membranvesikler er anriket ved høye sukrosekonsentrasjoner. Vesiklene som inneholder kontaktstedene, konsentrerer seg i middels sukrosekonsentrasjoner (figur 2). Følgende protokoll beskriver denne forbedrede metoden, som krever mindre spesialisert utstyr, tid og energi sammenlignet med vår tidligere etablerte32, i detalj og gir et nyttig verktøy for identifisering av mulige kontaktstedproteiner.
Mitokondriell subfraksjonering er et komplisert eksperiment med flere svært komplekse trinn. Derfor ønsket vi å ytterligere forbedre og til en viss grad forenkle vår etablerte metode32. Her var utfordringene kravet til komplisert og høyt spesialisert utstyr, som ofte er enkeltkonstruksjoner, og det enorme tids- og energiforbruket. Til dette formål prøvde vi å fjerne pumpene og individuelle konstruksjoner som ble brukt til støping og høsting av den lineære gradienten og endret til en tri…
The authors have nothing to disclose.
M.E.H. anerkjenner Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), prosjektnummer 413985647, for økonomisk støtte. Forfatterne takker Dr. Michael Kiebler, Ludwig-Maximilians University, München, for hans sjenerøse og omfattende støtte. Vi er takknemlige for Walter Neupert for hans vitenskapelige innspill, nyttige diskusjoner og løpende inspirasjon. JF takker Graduate School Life Science München (LSM) for støtte.
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm | Beckman Instruments, Germany | 344059 | |
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm | Beckman Instruments, Germany | 363647 | |
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g | Beckman Instruments, Germany | 363055 | |
Abbe refractometer | Zeiss, Germany | discontinued, any pipet controller will suffice |
|
accu-jet pro Pipet Controller | Brandtech, USA | BR26320 | discontinued, any pipet controller will suffice |
Beaker 1000 mL | DWK Life Science, Germany | C118.1 | |
Branson Digital Sonifier W-250 D | Branson Ultrasonics, USA | FIS15-338-125 | |
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP | Branson Ultrasonics, USA | 101-148-062 | |
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell | Branson Ultrasonics, USA | 15-338-70 | |
Centrifuge Avanti JXN-26 | Beckman Instruments, Germany | B37912 | |
Centrifuge Optima XPN-100 ultra | Beckman Instruments, Germany | 8043-30-0031 | |
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail | Roche, Switzerland | 11697498001 | |
D-Sorbit | Roth, Germany | 6213 | |
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Roth, Germany | 8043 | |
Erlenmeyer flask, 100 mL | Roth, Germany | X747.1 | |
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 | Hirschmann, Germany | 1180170 | |
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 | Hirschmann, Germany | 1180153 | |
ice bath | neoLab, Germany | S12651 | |
Magnetic stirrer RCT basic | IKA-Werke GmbH, Germany | Z645060GB-1EA | |
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) | Gerbu, Germany | 1081 | |
MyPipetman Select P1000 | Gilson, USA | FP10006S | |
MyPipetman Select P20 | Gilson, USA | FP10003S | |
MyPipetman Select P200 | Gilson, USA | FP10005S | |
Omnifix 1 mL | Braun, Germany | 4022495251879 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Serva, Germany | 32395.03 | |
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8×120 mm | Braun, Germany | 4022495052414 | |
stirring bar, 15 mm | VWR, USA | 442-0366 | |
Sucrose | Merck, Germany | S8501 | |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Instruments, Germany | 331362 | |
Test tubes | Eppendorf, Germany | 3810X | |
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel | VWR, USA | 432-0200 | |
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip | VWR, USA | 432-0212 | |
Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma Aldrich, Germany | 33731 | discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9) |
TRIS | Roth, Germany | 4855 |