Mikrokolonidannende enhedsassay til effektivitetsevaluering af vacciner mod tuberkulose
Summary
Bestemmelsen af kolonidannende enheder (CFU) er guldstandardteknikken til kvantificering af bakterier, herunder Mycobacterium tuberculosis , som kan tage uger at danne synlige kolonier. Her beskriver vi en mikro-CFU til CFU-bestemmelse med øget tidseffektivitet, reduceret laboratorieplads og reagensomkostninger og skalerbarhed til eksperimenter med medium og høj kapacitet.
Abstract
Tuberkulose (TB), den største dødsårsag på verdensplan af et smitstof, dræbte 1.6 millioner mennesker i 2022 og blev kun overgået af COVID-19 under pandemien 2019-2021. Sygdommen er forårsaget af bakterien Mycobacterium tuberculosis (M.tb). Mycobacterium bovis-stammen Bacillus Calmette-Guérin (BCG), den eneste TB-vaccine, er den ældste licenserede vaccine i verden, der stadig er i brug. I øjeblikket er der 12 vacciner i kliniske forsøg og snesevis af vacciner under præklinisk udvikling. Den foretrukne metode til vurdering af effekten af TB-vacciner i prækliniske undersøgelser er optælling af bakteriekolonier ved hjælp af den kolonidannende enheds (CFU) assay. Dette tidskrævende assay tager 4 til 6 uger at konkludere, kræver betydelig laboratorie- og inkubatorplads, har høje reagensomkostninger og er tilbøjelig til kontaminering. Her beskriver vi en optimeret metode til kolonitælling, mikro-CFU (mCFU), der tilbyder en enkel og hurtig løsning til at analysere M.tb-vaccinens effektivitetsresultater. mCFU-analysen kræver ti gange færre reagenser, reducerer inkubationsperioden tre gange, tager 1 til 2 uger at konkludere, reducerer laboratorieplads og reagensomkostninger og minimerer sundheds- og sikkerhedsrisici forbundet med at arbejde med et stort antal M.tb. For at evaluere effektiviteten af en TB-vaccine kan der desuden indhentes prøver fra en række forskellige kilder, herunder væv fra vaccinerede dyr, der er inficeret med mykobakterier. Vi beskriver også en optimeret metode til at producere en encellet, ensartet mykobakteriekultur af høj kvalitet til infektionsstudier. Endelig foreslår vi, at disse metoder bør anvendes universelt til prækliniske undersøgelser af bestemmelse af vaccineeffektivitet, hvilket i sidste ende fører til tidsreduktion i udviklingen af vacciner mod tuberkulose.
Introduction
Tuberkulose (TB) er den største dødsårsag på verdensplan af et enkelt infektiøst middel, bakterien Mycobacterium tuberculosis (M.tb), der dræber flere mennesker end noget andet patogen. I 2021 var TB ansvarlig for 1.6 millioner dødsfald og blev overgået af COVID-19 under pandemien 2019-20211. Ifølge Verdenssundhedsorganisationens globale TB-rapport fra 2022 var COVID-19-pandemien desuden ansvarlig for en stigning i nye TB-tilfælde. WHO rapporterer også om store fald i antallet af personer diagnosticeret med TB i denne periode, hvilket yderligere kan øge antallet af TB-tilfælde1.
Bacillus Calmette-Guérin (BCG) er en levende svækket stamme af den patogene Mycobacterium bovis, der blev brugt for første gang som vaccine for mere end 100 år siden. Dette er den eneste vaccine mod TB og er den ældste licenserede vaccine i verden, der stadig er i brug 2,3. I øjeblikket er der 12 vacciner i forskellige faser af kliniske forsøg4, og snesevis af vacciner er under præklinisk udvikling 5,6. Præklinisk vurdering af vacciner mod TB omfatter evaluering af sikkerhed og immunogenicitet7, som kan opnås i forskellige dyremodeller såsom zebrafisk, mus, marsvin, kaniner, kvæg og ikke-menneskelige primater 8,9,10. Derudover kræver vurdering af en vaccines evne til at inducere beskyttelse mod M.tb-infektion og/eller transmission, dvs. vaccineeffektiviteten, en M.tb-provokation in vivo 5,11. Interessant nok inducerer BCG-vaccination ikke-specifikke virkninger, der påvirker overlevelsen af andre bakterielle og virale patogener12,13 gennem mekanismen for trænet immunitet14. For at kvantificere den levedygtige bakteriebyrde i et inficeret dyr er den valgte metode tælling af bakteriekolonier gennem den kolonidannende enheds (CFU) assay 5,15. CFU er en enhed, der estimerer antallet af mikroorganismer (bakterier eller svampe), der danner kolonier under specifikke vækstbetingelser. CFU’er stammer fra levedygtige og replikative mikroorganismer, og det absolutte antal levende mikroorganismer inden for hver koloni er vanskeligt at estimere. Det er usikkert, om en koloni stammer fra en eller flere mikroorganismer. CFU-enheden afspejler denne usikkerhed, hvorfor der kan observeres en stor variation i replikater af den samme prøve. Dette tidskrævende assay kræver specialiserede teknikere, der er uddannet til at arbejde i et biosikkerhedsniveau 3 (BSL3) facilitet, betydeligt laboratorie- og inkubatorrum, tager fra 4 til 6 uger at konkludere og er tilbøjelig til forurening.
I denne undersøgelse beskriver vi en optimeret metode til kolonitælling, mikro-CFU (mCFU), og tilbyder en enkel og hurtig løsning til at analysere resultaterne 15,16,17,18,19,20. mCFU-analysen kræver ti gange færre reagenser, reducerer inkubationsperioden tre gange, tager 1 til 2 uger at konkludere, reducerer laboratorieplads og reagensomkostninger og minimerer sundheds- og sikkerhedsrisici forbundet med at arbejde med et stort antal M.tb. Vi foreslår, at denne metode anvendes universelt til prækliniske undersøgelser af bestemmelse af vaccineeffektivitet, hvilket i sidste ende fører til tidsreduktion i udviklingen af vacciner mod tuberkulose. Endelig er denne optimerede metode til CFU-tælling blevet brugt til at kvantificere ikke kun mykobakterier, men også andre bakterier, såsom Escherichia coli og Ralstonia solanacearum21.
Protocol
Representative Results
Discussion
TB er et vigtigt folkesundhedsproblem med stigende betydning, navnlig i lav- og mellemindkomstlande. Afbrydelsen af sundhedsindstillinger for at diagnosticere og behandle TB under COVID-19-pandemien forårsagede en negativ indvirkning på forekomsten af nye tilfælde1. Derudover skal multi-drug og extensivt lægemiddelresistente M.tb-stammer og co-infektion af M.tb og HIV behandles hurtigst muligt for at kontrollere denne epidemi 1,34<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af intern finansiering fra Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Universidade Católica Portuguesa, og ekstern finansiering fra Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) under tilskuddene UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 og EXPL/SAU-INF/0742/2021.
Materials
| 96-well plates | VWR | 734-2781 | |
| DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
| DSLR camera | Nikon | D3400 | |
| DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
| Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
| Multichannel pipette (0.5 – 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
| Multichannel pipette (20 – 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
| Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
| OADC enrichment | BD | 211886 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
| Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
| Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |
References
- World Health Organization. . Global Tuberculosis Report 2022. , (2022).
- Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).
- Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
- Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431 (2020).
- McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
- Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199 (2018).
- Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
- Young, D. Animal models of tuberculosis. European Journal of Immunology. 39 (8), 2011-2014 (2009).
- Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
- Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
- Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2 (2020).
- Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
- Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808 (2022).
- Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098 (2016).
- Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
- Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
- Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
- Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819 (2017).
- Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247 (2016).
- Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19 (2013).
- Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707 (2023).
- Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
- Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
- Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).
- Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202 (2020).
- Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
- Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447 (2012).
- Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478 (2017).
- McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944 (2022).
- Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728 (2021).
- Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
- Maartens, G., Wilkinson, R. J. Tuberculosis. The Lancet. 370 (9604), 2030-2043 (2007).
- Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691 (2023).
- Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
- Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
- Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460 (2020).
- Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
- Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257 (2021).
