La determinación de las unidades formadoras de colonias (UFC) es la técnica de referencia para cuantificar las bacterias, incluida la Mycobacterium tuberculosis , que puede tardar semanas en formar colonias visibles. Aquí describimos una micro-UFC para la determinación de UFC con mayor eficiencia de tiempo, menor espacio de laboratorio y costo de reactivos, y escalabilidad a experimentos de rendimiento medio y alto.
La tuberculosis (TB), la principal causa de muerte en todo el mundo por un agente infeccioso, mató a 1,6 millones de personas en 2022, solo superada por la COVID-19 durante la pandemia de 2019-2021. La enfermedad es causada por la bacteria Mycobacterium tuberculosis (M.tb). La cepa de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), la única vacuna contra la tuberculosis, es la vacuna autorizada más antigua del mundo, todavía en uso. Actualmente, hay 12 vacunas en ensayos clínicos y docenas de vacunas en desarrollo preclínico. El método de elección utilizado para evaluar la eficacia de las vacunas contra la tuberculosis en estudios preclínicos es la enumeración de las colonias bacterianas mediante el ensayo de unidades formadoras de colonias (UFC). Este ensayo, que requiere mucho tiempo, tarda entre 4 y 6 semanas en concluir, requiere un espacio considerable en el laboratorio y la incubadora, tiene altos costes de reactivos y es propenso a la contaminación. Aquí describimos un método optimizado para la enumeración de colonias, la micro-UFC (mCFU), que ofrece una solución simple y rápida para analizar los resultados de eficacia de la vacuna M.tb . El ensayo mCFU requiere diez veces menos reactivos, reduce el período de incubación tres veces, tardando de 1 a 2 semanas en concluir, reduce el espacio de laboratorio y el costo de los reactivos, y minimiza los riesgos para la salud y la seguridad asociados con el trabajo con grandes cantidades de M.tb. Además, para evaluar la eficacia de una vacuna contra la tuberculosis, se pueden obtener muestras de diversas fuentes, incluidos tejidos de animales vacunados infectados con micobacterias. También describimos un método optimizado para producir un cultivo de micobacterias unicelular, uniforme y de alta calidad para estudios de infección. Por último, proponemos que estos métodos se adopten universalmente para los estudios preclínicos de determinación de la eficacia de las vacunas, lo que en última instancia conducirá a una reducción del tiempo en el desarrollo de vacunas contra la tuberculosis.
La tuberculosis (TB) es la principal causa de muerte en todo el mundo por un solo agente infeccioso, la bacteria Mycobacterium tuberculosis (M.tb), que mata a más personas que cualquier otro patógeno. En 2021, la tuberculosis fue responsable de 1,6 millones de muertes y fue superada por la COVID-19 durante la pandemia de 2019-20211. Además, según el informe mundial sobre la tuberculosis de 2022 de la Organización Mundial de la Salud, la pandemia de COVID-19 fue responsable de un aumento de los nuevos casos de tuberculosis. La OMS también informa de grandes descensos en el número de personas diagnosticadas con tuberculosis durante este período, lo que podría aumentar aún más el número de casos de tuberculosis1.
El Bacillus Calmette-Guérin (BCG) es una cepa viva atenuada de la patógena Mycobacterium bovis, utilizada por primera vez como vacuna hace más de 100 años. Esta es la única vacuna contra la tuberculosis y es la vacuna autorizada más antigua en el mundo que aún se utiliza 2,3. Actualmente, hay 12 vacunas en diferentes fases de ensayos clínicos4, y decenas de vacunas están en desarrollo preclínico 5,6. La evaluación preclínica de las vacunas contra la TB incluye la evaluación de la seguridad e inmunogenicidad7, que se puede obtener en diversos modelos animales como pez cebra, ratones, cobayas, conejos, bovinos y primates no humanos 8,9,10. Además, la evaluación de la capacidad de una vacuna para inducir protección contra la infección y/o transmisión por M.tb, es decir, la eficacia de la vacuna, requiere un desafío con M.tb in vivo 5,11. Curiosamente, la vacunación con BCG induce efectos inespecíficos que afectan la supervivencia de otros patógenos bacterianos y virales12,13 a través del mecanismo de inmunidad entrenada14. Para cuantificar la carga bacteriana viable en un animal infectado, el método de elección es la enumeración de colonias bacterianas a través del ensayo de unidades formadoras de colonias (UFC) 5,15. La UFC es una unidad que estima el número de microorganismos (bacterias u hongos) que forman colonias en condiciones específicas de crecimiento. Las UFC se originan a partir de microorganismos viables y replicativos, y el número absoluto de microorganismos vivos dentro de cada colonia es difícil de estimar. No se sabe con certeza si una colonia se ha originado a partir de uno o más microorganismos. La unidad UFC refleja esta incertidumbre, por lo que se puede observar una gran variabilidad en las réplicas de una misma muestra. Este ensayo, que requiere mucho tiempo, requiere técnicos especializados capacitados para trabajar en una instalación de nivel de bioseguridad 3 (BSL3), un espacio considerable en el laboratorio y la incubadora, tarda de 4 a 6 semanas en concluir y es propenso a la contaminación.
En este estudio, describimos un método optimizado para la enumeración de colonias, la micro-UFC (mCFU), y ofrecemos una solución simple y rápida para analizar los resultados 15,16,17,18,19,20. El ensayo mCFU requiere diez veces menos reactivos, reduce el período de incubación tres veces, tardando de 1 a 2 semanas en concluir, reduce el espacio de laboratorio y el costo de los reactivos, y minimiza los riesgos para la salud y la seguridad asociados con el trabajo con grandes cantidades de M.tb. Proponemos que este método se adopte universalmente para los estudios preclínicos de determinación de la eficacia de las vacunas, lo que en última instancia conducirá a una reducción del tiempo en el desarrollo de vacunas contra la tuberculosis. Finalmente, este método optimizado de enumeración de UFC se ha utilizado para cuantificar no solo micobacterias sino también otras bacterias, como Escherichia coli y Ralstonia solanacearum21.
La tuberculosis es un importante problema de salud pública con una importancia creciente, especialmente en los países de ingresos bajos y medios. La interrupción de los entornos sanitarios para diagnosticar y tratar la tuberculosis durante la pandemia de COVID-19 tuvo un impacto negativo en la incidencia de nuevos casos1. Además, las cepas de M.tb multirresistentes y ampliamente resistentes, así como la coinfección de M.tb y VIH, deben abordarse con urgencia para controlar …
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo contó con el apoyo de financiación interna de la Facultad de Medicina de la Universidad Católica Portuguesa y de la Fundación para la Ciencia y Tecnología (FCT), en el marco de las subvenciones UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 y EXPL/SAU-INF/0742/2021.
96-well plates | VWR | 734-2781 | |
DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
DSLR camera | Nikon | D3400 | |
DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
Multichannel pipette (0.5 – 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
Multichannel pipette (20 – 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
OADC enrichment | BD | 211886 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |