Denne undersøgelse beskriver decellulariseringsbaserede metoder til visualisering og kvantificering af intramuskulært fedtvæv (IMAT) aflejring gennem intakt muskelvolumen samt kvantificering af målinger af individuelle adipocytter, der omfatter IMAT.
Fedtinfiltration er akkumulering af adipocytter mellem myofibre i skeletmuskulatur og er et fremtrædende træk ved mange myopatier, stofskifteforstyrrelser og dystrofier. Klinisk i humane populationer vurderes fedtinfiltration ved hjælp af ikke-invasive metoder, herunder computertomografi (CT), magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) og ultralyd (US). Selvom nogle undersøgelser har brugt CT eller MR til at kvantificere fedtinfiltration i musemuskler, er omkostninger og utilstrækkelig rumlig opløsning fortsat udfordrende. Andre smådyrsmetoder bruger histologi til at visualisere individuelle adipocytter; Denne metode lider imidlertid af prøveudtagningsbias i heterogen patologi. Denne protokol beskriver metoden til kvalitativt at se og kvantitativt måle fedtinfiltration omfattende gennem intakt musemuskel og på niveau med individuelle adipocytter ved hjælp af decellularisering. Protokollen er ikke begrænset til specifikke muskler eller specifikke arter og kan udvides til menneskelig biopsi. Derudover kan grove kvalitative og kvantitative vurderinger foretages med standard laboratorieudstyr til lave omkostninger, hvilket gør denne procedure mere tilgængelig på tværs af forskningslaboratorier.
Akkumuleringen af adipocytter mellem myofibre i skeletmuskulaturen er et fremtrædende træk ved forskellige tilstande, fra type 2-diabetes til sarkopeni til muskuloskeletale skader 1,2,3,4,5,6,7. Omfattende vurdering af dette intramuskulære fedtvæv (IMAT) er afgørende for at forstå patogenesen af disse tilstande, da IMAT-aflejring er stærkt korreleret med insulinresistens 3,8,9,10 og dårlig skeletmuskelfunktion 11,12,13,14,15 . Selv om disse sammenhænge er blevet bemærket i årtier, er de mekanismer, der er forbundet med og oprindelsen af IMAT, stadig et område, hvor IMAT undersøges intenst. Dette skyldes dels, at de fleste undersøgelser, der vurderer skeletmuskulaturens fedtinfiltration, er blevet udført hos mennesker, hvor mekanistiske undersøgelser er begrænsede16,17. Men for nylig er små dyremodeller, herunder mus, blevet brugt til at hjælpe med at lokalisere cellulær regulering af IMAT-udvikling og signalering18,19,20. Dette arbejde har til formål at give et nyt værktøj til brug med små dyremodeller til kvalitativ visualisering og kvantificering af skeletmuskulaturens fedtinfiltration.
Klinisk i humane populationer vurderes fedtinfiltration ved hjælp af ikke-invasive metoder, herunder computertomografi (CT) 6,21, magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) 16,17,22,23 og ultralyd (US) 17,24. Disse billeddannelsesteknikker identificerer typisk et defineret interesseområde (ROI) i en muskel og erhverver billedskiver inden for denne region, selvom omfattende tilgange også er blevet anvendt25,26,27. Disse billedudsnit underkastes kvalitativ klassificering6 og kvantificeres via pixeltærskel28. Lignende metoder er blevet anvendt hos dyr, der tidligerevar 29,30; De er dog dyre og kræver adgang til billeddannelsessystemer til små dyr. Rumlig opløsning via CT- og MR-brug udgør også et stort problem, da de ikke er i stand til at afgrænse IMAT-adipocytter fra skeletmuskelfibre inden for en voxel og i stedet stole på subjektiv adskillelse af primært muskelregioner og primært IMAT-regioner31,32. Som sådan præsenterer manglende evne til nøjagtigt at identificere fedt eller muskelvæv også unøjagtig kvantificering af repræsentative mængder af disse væv.
På grund af disse begrænsninger er nuværende teknikker til vurdering af skeletmuskulaturfedtinfiltration i små dyremodeller oftest afhængige af histologi som et billigt og tilgængeligt alternativ33,34. Standardfarvningsprocedurer, herunder hæmatoxylin og eosin (H&E), olierød O (ORO) og immunfarvning til adipocytmarkører såsom perilipin, muliggør enkel påvisning og visualisering af adipocytter, der omfatter fedtinfiltration i musklen. Imidlertid er histologiske tilgange sjældent omfattende, og typisk er IMAT kvalitativ eller kvantitativ vurdering begrænset til et enkelt afsnit34. Lipidekstraktion er også blevet brugt til at kvantificere samlede muskellipider35; Denne teknik skelner imidlertid ikke mellem intramyocellulært lipid (IMCL) og intramuskulært fedtvæv (IMAT) lagre36. Sammenfattende er de nuværende metoder til at visualisere og kvantificere fedt i muskler fortsat begrænset enten af økonomiske omkostninger eller den specifikke påvisning af IMAT.
Her beskriver vi en detaljeret metode til vurdering af skeletmuskulaturens fedtinfiltration både ved kvalitativ visualisering og kvantificering i flere skalaer. Denne metode anvender en simpel decellulariseringsteknik, der fjerner myocellulære strukturer, herunder IMCL, men holder de større IMAT-adipocytafledte lipiddråber intakte. Validering af specificiteten af denne teknik er blevet offentliggjort37, herunder anvendelse af lipidekstraktion til at vise udtømning af IMCL med decellularisering, μCT til at vise tilbageholdelse af IMAT-mønster med decellularisering og histologi til at vise den tilsvarende størrelsesfordeling af IMAT-lipiddråber sammenlignet med dem, der er identificeret med decellularisering. Når de er decellulariseret, kan musklerne farves med lipidopløselige farvestoffer til kvalitativ visualisering af mønsteret og omfanget af fedtinfiltration og / eller kvantitativ billeddannelse af individuelle IMAT-lipiddråber. Farvestoffer kan efterfølgende ekstraheres med isopropanol, og den optiske densitet (OD) af den resulterende opløsning kan anvendes til at estimere IMAT-lipidvolumenet. Den strenge validering af denne teknik er offentliggjort andetsteds37. Denne artikel indeholder en detaljeret protokol til brug af denne metode med musemuskler og giver fejlfindingstip til at understøtte vedtagelsen af denne metode i andre applikationer, såsom muskler fra andre arter eller andet væv.
Dette manuskript beskriver metoder til kvalitativt at visualisere og kvantificere skeletmuskulaturens fedtinfiltration i små dyremodeller, der kan anvendes til yderligere forståelse af patogenesen af intramuskulær fedtvæv (IMAT) udvikling og patologisk ekspansion. Brugen af helmuskeldecellularisering og lipidopløselig farvning giver mulighed for en omkostningseffektiv, reproducerbar og enkel metode til omfattende vurdering af tilstedeværelsen af IMAT i hele muskler.
Grundlaget for denne protokol er, at decellularisering af muskler med SDS fjerner de cellulære komponenter i myofibre, herunder de små lipiddråber af IMCL, men skåner de store lipiddråber i intramyocellulære adipocytter. SDS er blevet brugt i vid udstrækning42 i vævsteknik til at decellularisere matricer. Væv som fedt og skeletmuskulatur kræver typisk yderligere mekanisk dissociation og / eller alkoholekstraktion for at fjerne det resterende adipocytlipid42,43. Vi har tidligere vist, at dette skyldes, at mens decellularisering med SDS eliminerer IMCL, skåner det den store lipiddråbe i adipocytter37. Billeddannelse af osmiumtetroxidfarvet intakt muskel før og efter decellularisering med μCT verificerede, at det rumlige mønster af IMAT ikke blev forstyrret af decellularisering. Endvidere var intramuskulær triglyceridkvantificering i en decellulariseret muskel med ubetydelig IMAT ~5% af de intakte muskelværdier, hvilket verificerede fjernelsen af IMCL. Derfor bevarer denne metode IMAT-lipiddråber i deres oprindelige anatomiske fordeling gennem en halvgennemsigtig muskelmatrix.
Korrekt decellularisering er det mest kritiske trin i denne protokol. Hvis decellulariseringen er ufuldstændig, vil IMAT-lipiddråber være vanskelige at visualisere, og resterende IMCL vil forårsage høj baggrundsfarvning med enten ORO eller BODIPY (figur 2). Almindelige fejl hos uerfarne brugere er utilstrækkelig SDS-dækning pr. muskel (inden for hver brønd), således at hver muskel ikke er helt dækket af SDS-opløsning, ikke bruger en vipper til at agitere opløsningen under decellularisering og ikke udfører opløsningsændringer ofte nok. I dette manuskript har vi anbefalet den nødvendige mængde SDS pr. muskelmasseenhed, men brugeren skal stadig sikre, at musklerne er fuldstændigt dækket af løsninger, da hver muskel har en unik geometri. Brugere anbefales også at ændre løsningerne liberalt (så meget som to gange om dagen) for at sikre, at decellularisering er afsluttet. Farvning af IMAT-lipiddråber af god kvalitet er opnået efter så mange som 4 dages SDS-behandling. For ORO-farvningsresultater af høj kvalitet er tilstrækkelig fiksering og forberedelse af ORO-opløsning også vigtig. I lighed med SDS-behandlingen beskrevet ovenfor er der behov for tilstrækkelig dækning af 3,7% formaldehydopløsning for hver muskelprøve. Hvis musklen fjernes fra fikseringsmidlet for tidligt, vil lipiddråber kun svagt plette med ORO. I alt 1-2 timer bør være tilstrækkeligt, men natten over anbefales fiksering for at sikre, at fikseringsmidlet trænger ind i midten af musklen og løser alle lipiddråber fuldt ud. En yderligere udfordring med ORO-farvning er, at når alkoholkoncentrationen reduceres til 60%, begynder der at dannes partikler. Disse partikler kan slå sig ned på overfladen og sidde fast på muskelgrænsen. Den bedste måde at undgå dette på er at lave en frisk arbejdsløsning til hver farvning og bruge både 40 mesh μm og 0,22 μm filtre. Derefter vil opretholdelse af omrøring med vipperen og begrænsning af farvningstiden til 10 minutter hjælpe med at forhindre, at eventuelle partikler, der dannes, sætter sig. Hvis problemet fortsætter, kan det hjælpe at lave en frisk ORO-lagerløsning. Hvis nogle artefakter forbliver fast på den decellulariserede muskeloverflade, kan et stereomikroskop, tang og kirurgisk saks bruges til at fjerne denne artefakt. Undladelse af at eliminere artefakter vil påvirke billedkvaliteten af muskler og overvurdere IMAT-indhold under lipidekstraktionsdelen som forberedelse til OD-læsning.
Samlet set er denne teknik ligetil og giver flere fordele i forhold til guldstandardmetoder til visualisering og kvantificering af skeletmuskulaturfedtinfiltration. Ikke-invasive teknikker, såsom CT, MR og US, som anvendes i vid udstrækning hos mennesker og undertiden i dyremodeller, har begrænset rumlig opløsning og er ude af stand til at skelne lipiddråber fra muskelfibre. Således tildeles en pixel eller voxel med mellemliggende signalintensitet som “muskel” eller “fedt”, mens det i virkeligheden sandsynligvis er en blanding af myofibre og adipocytter. Mere almindeligt vurderes fedtinfiltration i dyremuskler ved histologi, oftest ved ORO i muskelkryosektioner. Dette udføres dog typisk kun i et enkelt repræsentativt afsnit og er vanskeligt at kvantificere på grund af lipidspredning over sektionen. I modsætning hertil giver ORO-farvning af en hel decellulariseret muskel en omfattende vurdering af IMAT med lignende omkostninger og indsats som intakt morfologi. Ud over at forbedre visualiseringen muliggør ORO-farvning af decellularisering desuden kvantificering af fedtinfiltration ved lipidekstraktion. For et dybere dykke ned i funktionerne ved fedtinfiltration kan en fluorescerende plet, BODIPY, bruges sammen med konfokal mikroskopi. Dette gør det muligt at rekonstruere individuelle IMAT-lipiddråber for at kortlægge 3D-landskabet, hvilket ikke er muligt med histologi, medmindre sektioner analyseres over muskelens længde. Mens et konfokalmikroskop ikke er standard laboratorieudstyr, er det mere sandsynligt, at det er tilgængeligt på et universitet eller i industrien end MR eller CT for små dyr. Desuden kan meget af denne proces automatiseres, hvilket reducerer tidsomkostningerne sammenlignet med sekventiel histologi. Optimering af indstillingerne på det konfokale mikroskop er en yderligere overvejelse for BODIPY-farvning. Disse er unikke for hvert mikroskop. Den kritiske værdi er laserintensitet, som skal være høj nok til at detektere lipiddråberne på den fjerne overflade af musklen, samtidig med at signalet fra lipiddråberne på forsiden ikke mættes. På grund af dette foreslås det, at brug af BODIPY-farvning med konfokalmikroskopi er bedst egnet på tyndere muskler, herunder EDL eller membran.
Flere begrænsninger ved denne tilgang fortjener diskussion. For det første, mens det forventes, at denne teknik har bred anvendelighed ud over skademodeller (kardiotoksin og glycerol) hos mus, der præsenteres her, kan nye applikationer (f.eks. MDX-modellen) kræve optimering, da muskelens størrelse og sammensætning (f.eks. fibrose) kan påvirke decellularisering, hvilket kræver øget SDS-koncentration eller inkubationstider. Andre sygdomsmodeller med ændret muskelmasse ville også kræve analyse af både absolutte og normaliserede (til muskelmasse) målinger af fedtinfiltration for at bestemme den absolutte mængde lipid eller procentdel af lipid i forhold til muskelvolumenet for at give et mere meningsfuldt resultatmål. Desuden forventes denne teknik at være bredt anvendelig til større dyremodeller og humane biopsier, men dette kan kræve optimering for hver ny applikation. For det andet skal hele musklen i denne strategi være dedikeret til dette assay og kan ikke bruges til at vurdere et andet patologisk træk. Undersøgelser, der sigter mod at vurdere langsgående ændringer i IMAT, er bedre tjent med ikke-invasive billeddannelsesteknikker, og undersøgelser, hvis primære mål kræver, at musklen til andre formål (histologi, kvantitativ polymerasekædereaktion, western blotting) er bedre tjent med histologisk vurdering, da resten af den frosne muskel kan allokeres til andre assays. Dette assay er imidlertid velegnet til parring med in vivo-test, såsom løbebåndskørsel eller ex vivo-kontraktil test, da disse foranstaltninger kan foretages før decellularisering44. For det tredje, selvom brugen af BODIPY-plet med konfokal mikroskopi giver visualisering og kvantificering af lipiddråber i høj opløsning, kan den ikke endeligt identificere lipiddråber som individuelle adipocytter, da cellemembranen fjernes, og endogene adipocytproteiner går tabt. Multilokulære adipocytter, der repræsenterer umodne adipocytter eller en “brun / beige” fænotype, kan identificeres som flere lipiddråber. Endelig fungerer protokollen ikke godt på tidligere frosne muskler. Disse begrænsninger er sandsynligvis mest dybtgående for humane biopsier, da mens hele biopsien kan decellulariseres, er den rumlige fordeling af IMAT i biopsien sandsynligvis ikke mere repræsentativ for hele musklen end en histologisk skive. Men da denne teknik er relativt ufølsom over for ufrosne biopsihåndteringsbetingelser (f.eks. timer på is i PBS), kunne biopsien opdeles senere for forskellige assays, herunder en del til decellularisering, hvilket ville give en bedre opløsning af individuelle lipiddråber.
Afslutningsvis er en ny metode til kvalitativ og kvantitativ analyse af skeletmuskulaturens fedtinfiltration blevet udviklet ved farvning og billeddannelse af det tilbageholdte lipid af decellulariserede konstruktioner. Denne metode tilbyder forbedringer i forhold til guldstandardtilgange, idet den muliggør omfattende billeddannelse af tredimensionel fedtinfiltration i muskler og hurtig, billig kvantificering med ORO-farvning. For mere detaljerede målinger giver en anden lipidopløselig BODIPY-plet en mere detaljeret kvantificering af lipiddråbeantal, volumen og fordelingsmønster, som afbildet ved konfokal mikroskopi. Sammen giver disse målinger forskere en måde at præcist måle skeletmuskulaturens fedtinfiltration på niveauet af de enkelte lipiddråber uden prøveudtagning eller dyr ikke-invasiv billeddannelse.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af R01AR075773 to GAM.
0.22 µm Syringe Filter | Fisher Scientific | SLGP033RS | |
1 mL LuerLock Syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
12 mm Coverslips | Fisher Scientific | 12545F | |
12 well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
24 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
2-Propanol (Isopropanol) | Sigma Aldrich | I9516 | 0.5 mg/mL stock solution can be stored at room temperature for 1 month. Working solution must be made fresh. |
37% Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 8187081000 | |
40 µm Mesh Filter | Fisher Scientific | 87711 | |
6 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
96 well plates | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
BODIPY 493/503 | Fisher Scientific | D-3922 | |
C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
Confocal Imaging Dish | VWR | 734-2905 | |
Confocal Microscope | Leica | TCS SPEII | |
Dissecting/stereo Microscope | Zeiss | 4107009123001000 | |
Dissection scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 033361.K2 | |
ImageJ | NIH | ||
Matlab | Mathworks | ||
Oil Red O Powder | Sigma Aldrich | O0625 | |
Plate reader | Bio-tek | Synergy II | |
Rocker/Shaker | Reliable Scientific | 55D | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | 1% Solution can be stored at room temperature for 1 month |
Transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119D | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 |