वर्तमान अध्ययन में बरकरार मांसपेशियों की मात्रा के माध्यम से इंट्रामस्क्युलर एडीपोज ऊतक (आईएमएटी) जमाव को देखने और मात्रा निर्धारित करने के लिए डीसेल्युलराइजेशन आधारित पद्धतियों का वर्णन किया गया है, साथ ही व्यक्तिगत एडिपोसाइट्स के मैट्रिक्स को निर्धारित किया गया है जिसमें आईमैट शामिल है।
फैटी घुसपैठ कंकाल की मांसपेशियों में मायोफाइबर के बीच एडिपोसाइट्स का संचय है और कई मायोपैथियों, चयापचय संबंधी विकारों और डिस्ट्रोफी की एक प्रमुख विशेषता है। नैदानिक रूप से मानव आबादी में, फैटी घुसपैठ का मूल्यांकन गैर-आक्रामक तरीकों का उपयोग करके किया जाता है, जिसमें कंप्यूटेड टोमोग्राफी (सीटी), चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), और अल्ट्रासाउंड (यूएस) शामिल हैं। हालांकि कुछ अध्ययनों ने माउस की मांसपेशियों में फैटी घुसपैठ को मापने के लिए सीटी या एमआरआई का उपयोग किया है, लागत और अपर्याप्त स्थानिक संकल्प चुनौतीपूर्ण बने हुए हैं। अन्य छोटे पशु विधियां व्यक्तिगत एडिपोसाइट्स की कल्पना करने के लिए हिस्टोलॉजी का उपयोग करती हैं; हालांकि, यह पद्धति विषम विकृति विज्ञान में नमूना पूर्वाग्रह से ग्रस्त है। यह प्रोटोकॉल गुणात्मक रूप से देखने और मात्रात्मक रूप से फैटी घुसपैठ को पूरे बरकरार माउस मांसपेशियों में और डीसेलुलराइजेशन का उपयोग करके व्यक्तिगत एडिपोसाइट्स के स्तर पर मापने के लिए कार्यप्रणाली का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल विशिष्ट मांसपेशियों या विशिष्ट प्रजातियों तक सीमित नहीं है और इसे मानव बायोप्सी तक बढ़ाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, सकल गुणात्मक और मात्रात्मक आकलन कम लागत के लिए मानक प्रयोगशाला उपकरणों के साथ किया जा सकता है, जिससे इस प्रक्रिया को अनुसंधान प्रयोगशालाओं में अधिक सुलभ बनाया जा सकता है।
कंकाल की मांसपेशी के भीतर मायोफाइबर के बीच एडिपोसाइट्स का संचय असमान स्थितियों की एक प्रमुख विशेषता है, टाइप 2 मधुमेह से सरकोपेनिया से मस्कुलोस्केलेटल चोट1,2,3,4,5,6,7 तक। इन स्थितियों के रोगजनन को समझने के लिए इस इंट्रामस्क्युलर एडीपोज ऊतक (आईएमएटी) का व्यापक मूल्यांकन महत्वपूर्ण है, क्योंकि आईएमएटी जमाव इंसुलिन प्रतिरोध 3,8,9,10 और खराब कंकाल की मांसपेशी समारोह 11,12,13,14,15 के साथ दृढ़ता से सहसंबद्ध है।. यद्यपि इन संघों को दशकों से नोट किया गया है, लेकिन आईएमएटी से जुड़े तंत्र और उत्पत्ति अभी भी गहन जांच का क्षेत्र बनी हुई है। यह आंशिक रूप से है क्योंकि कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ का आकलन करने वाले अधिकांश अध्ययन मनुष्यों में किए गए हैं, जहां यांत्रिक जांच16,17 तक सीमित है। हालांकि, हाल ही में, चूहों सहित छोटे पशु मॉडल का उपयोग आईमैट विकास और सिग्नलिंग18,19,20 के सेलुलर विनियमन को इंगित करने में मदद करने के लिए किया गया है। इस काम का उद्देश्य कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ को गुणात्मक रूप से देखने और मात्रा निर्धारित करने के लिए छोटे पशु मॉडल के साथ उपयोग के लिए एक नया उपकरण प्रदान करना है।
नैदानिक रूप से मानव आबादी में, फैटी घुसपैठ का मूल्यांकन गैर-आक्रामक तरीकों का उपयोग करके किया जाता है, जिसमें कंप्यूटेड टोमोग्राफी (सीटी) 6,21, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) 16,17,22,23 और अल्ट्रासाउंड (यूएस) 17,24 शामिल हैं। ये इमेजिंग तकनीक ें आम तौर पर एक मांसपेशी में रुचि के परिभाषित क्षेत्र (आरओआई) की पहचान करती हैं और उस क्षेत्र के भीतर छवि स्लाइस प्राप्त करती हैं, हालांकि व्यापक दृष्टिकोण भी नियोजित किए गए हैं25,26,27. इन छवि स्लाइस को गुणात्मक ग्रेडिंग6 के अधीन किया जाता है और पिक्सेल थ्रेशोल्डिंग28 के माध्यम से परिमाणित किया जाता है। इसी तरह के दृष्टिकोण का उपयोग जानवरों में पहले29,30 में किया गया है; हालांकि, वे महंगे हैं और छोटे पशु इमेजिंग सिस्टम तक पहुंच की आवश्यकता होती है। सीटी और एमआरआई उपयोग के माध्यम से स्थानिक संकल्प भी एक प्रमुख मुद्दा प्रस्तुत करता है, क्योंकि वे एक वोक्सेल के भीतर कंकाल की मांसपेशी फाइबर से आईमैट एडिपोसाइट्स को चित्रित करने में असमर्थ हैं और इसके बजाय मुख्य रूप से मांसपेशी क्षेत्रों और मुख्य रूप से आईमैट क्षेत्रों31,32 के व्यक्तिपरक पृथक्करण पर भरोसा करते हैं। जैसे, वसा या मांसपेशियों के ऊतकों की सटीक पहचान करने में असमर्थता भी इन ऊतकों की प्रतिनिधि मात्रा की गलत मात्रा प्रस्तुत करती है।
इन सीमाओं के कारण, छोटे पशु मॉडल में कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ का आकलन करने की वर्तमान तकनीक आमतौर पर एक सस्ती और सुलभ विकल्प33,34 के रूप में हिस्टोलॉजी पर भरोसा करती है। हेमटोक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई), ऑयल रेड ओ (ओआरओ), और पेरिलिपिन जैसे एडिपोसाइट्स मार्करों के लिए इम्यूनोस्टेनिंग सहित मानक धुंधला प्रक्रियाएं, मांसपेशियों के भीतर फैटी घुसपैठ वाले एडिपोसाइट्स का सरल पता लगाने और विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती हैं। हालांकि, हिस्टोलॉजी दृष्टिकोण शायद ही कभी व्यापक होते हैं, और आमतौर पर, आईमैट गुणात्मक या मात्रात्मक मूल्यांकन एक खंड34 तक सीमित होता है। लिपिड निष्कर्षण का उपयोग कुल मांसपेशी लिपिड35 को निर्धारित करने के लिए भी किया गया है; हालांकि, यह तकनीक इंट्रामायोसेलुलर लिपिड (आईएमसीएल) और इंट्रामस्क्युलर एडीपोज ऊतक (आईएमएटी) स्टोर36 के बीच अंतर करने में विफल रहती है। सारांश में, मांसपेशियों में वसा की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए वर्तमान पद्धतियां या तो वित्तीय लागत या आईएमएटी की विशिष्ट पहचान तक सीमित हैं।
यहां, हम गुणात्मक विज़ुअलाइज़ेशन और मल्टी-स्केल परिमाणीकरण दोनों द्वारा कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ का आकलन करने के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करते हैं। यह पद्धति एक सरल डीसेलुलराइजेशन तकनीक को नियोजित करती है जो आईएमसीएल सहित मायोसेलुलर संरचनाओं को हटा देती है, लेकिन बड़े आईमैट एडिपोसाइट-व्युत्पन्न लिपिड बूंदों को बरकरार रखती है। इस तकनीक की विशिष्टता कासत्यापन प्रकाशित किया गया है, जिसमें डीसेलुलराइजेशन के साथ आईएमसीएल की कमी को दिखाने के लिए लिपिड निष्कर्षण का उपयोग करना, डीसेलुलराइजेशन के साथ आईमैट पैटर्निंग के प्रतिधारण को दिखाने के लिए μCT, और डीसेलुलराइजेशन के साथ पहचाने गए लोगों की तुलना में IMAT लिपिड बूंदों के समान आकार वितरण को दिखाने के लिए हिस्टोलॉजी शामिल है। एक बार डीसेल्युलराइज्ड होने के बाद, मांसपेशियों को पैटर्न के गुणात्मक विज़ुअलाइज़ेशन और फैटी घुसपैठ की सीमा और / या व्यक्तिगत आईएमएटी लिपिड बूंदों की मात्रात्मक इमेजिंग के लिए लिपिड-घुलनशील रंगों से रंगा जा सकता है। रंगों को बाद में आइसोप्रोपेनोल के साथ निकाला जा सकता है, और परिणामस्वरूप समाधान के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) का उपयोग आईमैट लिपिड मात्रा का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक का कड़ा सत्यापन अन्यत्र प्रकाशित किया गयाहै। यह आलेख माउस की मांसपेशियों के साथ इस पद्धति का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है और अन्य अनुप्रयोगों में इस पद्धति को अपनाने का समर्थन करने के लिए समस्या निवारण युक्तियां प्रदान करता है, जैसे कि अन्य प्रजातियों या अन्य ऊतकों की मांसपेशियां।
यह पांडुलिपि छोटे पशु मॉडल में कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ को गुणात्मक रूप से कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के तरीकों का वर्णन करती है जिसे इंट्रामस्क्युलर एडीपोज ऊतक (आईएमएटी) विकास और पैथोलॉजिकल विस्तार के रोगजनन को समझने के लिए लागू किया जा सकता है। पूरे मांसपेशियों के विकोशिकीयकरण और लिपिड-घुलनशील धुंधलापन का उपयोग पूरी मांसपेशियों में आईमैट की उपस्थिति का व्यापक रूप से आकलन करने के लिए एक लागत प्रभावी, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सरल पद्धति की अनुमति देता है।
इस प्रोटोकॉल का आधार यह है कि एसडीएस के साथ मांसपेशियों का विकोशिकीयकरण आईएमसीएल की छोटी लिपिड बूंदों सहित मायोफाइबर के सेलुलर घटकों को हटा देता है, लेकिन इंट्रामायोसेलुलर एडिपोसाइट्स में बड़ी लिपिड बूंदों को छोड़ देता है। एसडीएस का उपयोग ऊतक इंजीनियरिंग में बड़े पैमाने परमैट्रिसेस को डीसेल्यूलर करने के लिए किया गया है। वसा और कंकाल की मांसपेशी जैसे ऊतकों को आमतौर पर अवशिष्ट एडिपोसाइट्स लिपिड42,43 को हटाने के लिए अतिरिक्त यांत्रिक पृथक्करण और / या अल्कोहल निष्कर्षण की आवश्यकता होती है। हमने पहले दिखाया है कि ऐसा इसलिए है क्योंकि एसडीएस के साथ डीसेल्युलराइजेशन आईएमसीएल को समाप्त करता है, यह एडिपोसाइट्स37 में बड़ी लिपिड बूंद को बचाता है। μCT के साथ ऑस्मियम टेट्रोक्साइड-दाग वाली बरकरार मांसपेशियों की इमेजिंग ने सत्यापित किया कि IMAT का स्थानिक पैटर्न डीसेलुलराइजेशन द्वारा बाधित नहीं था। इसके अलावा, नगण्य आईमैट के साथ एक डीसेल्यूलराइज्ड मांसपेशी में इंट्रामस्क्युलर ट्राइग्लिसराइड परिमाणीकरण बरकरार मांसपेशी मूल्यों का ~ 5% था, जो आईएमसीएल को हटाने की पुष्टि करता है। इसलिए, यह पद्धति एक अर्ध-पारदर्शी मांसपेशी मैट्रिक्स के माध्यम से अपने मूल शारीरिक वितरण में आईमैट लिपिड बूंदों को बरकरार रखती है।
इस प्रोटोकॉल में उचित डीसेल्युलराइजेशन सबसे महत्वपूर्ण कदम है। यदि डीसेल्युलराइजेशन अधूरा है, तो आईमैट लिपिड बूंदों की कल्पना करना मुश्किल होगा और अवशिष्ट आईएमसीएल ओआरओ या बीओडीआईपीवाई (चित्रा 2) के साथ उच्च पृष्ठभूमि धुंधला कर देगा। अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं द्वारा सामान्य त्रुटियां प्रति मांसपेशी (प्रत्येक कुएं के भीतर) अपर्याप्त एसडीएस कवरेज हैं, जैसे कि प्रत्येक मांसपेशी एसडीएस समाधान में पूरी तरह से कवर नहीं होती है, डीसेलुलराइजेशन के दौरान समाधान को उत्तेजित करने के लिए रॉकर का उपयोग नहीं करती है, और समाधान परिवर्तन अक्सर पर्याप्त नहीं करती है। इस पांडुलिपि में, हमने प्रति यूनिट मांसपेशी द्रव्यमान के लिए आवश्यक एसडीएस की मात्रा की सिफारिश की है, लेकिन उपयोगकर्ता को अभी भी यह सुनिश्चित करने की आवश्यकता होगी कि मांसपेशियों को पूरी तरह से समाधान द्वारा कवर किया गया है, क्योंकि प्रत्येक मांसपेशी में एक अद्वितीय ज्यामिति है। उपयोगकर्ताओं को यह सुनिश्चित करने के लिए उदारतापूर्वक (प्रति दिन दो बार) समाधान बदलने की भी सिफारिश की जाती है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि डीसेलुलराइजेशन पूरा हो गया है। एसडीएस उपचार के 4 दिनों के बाद आईमैट लिपिड बूंदों की अच्छी गुणवत्ता का धुंधलापन हासिल किया गया है। उच्च गुणवत्ता वाले ओआरओ धुंधला परिणामों के लिए, पर्याप्त निर्धारण और ओआरओ समाधान तैयारी भी महत्वपूर्ण है। ऊपर वर्णित एसडीएस उपचार के समान, प्रत्येक मांसपेशी नमूने के लिए 3.7% फॉर्मलाडेहाइड समाधान की पर्याप्त कवरेज की आवश्यकता होती है। यदि मांसपेशियों को फिक्सेटिव से बहुत जल्दी हटा दिया जाता है, तो लिपिड बूंदें केवल ओआरओ के साथ कमजोर दाग देंगी। कुल 1-2 घंटे पर्याप्त होना चाहिए, लेकिन यह सुनिश्चित करने के लिए रातोंरात निर्धारण की सिफारिश की जाती है कि फिक्सेटिव मांसपेशियों के केंद्र में प्रवेश करता है और सभी लिपिड बूंदों को पूरी तरह से ठीक करता है। ओआरओ धुंधला होने के साथ एक अतिरिक्त चुनौती यह है कि जब अल्कोहल एकाग्रता 60% तक कम हो जाती है, तो एक कण बनना शुरू हो जाता है। यह कण सतह पर बस सकता है और मांसपेशियों की सीमा पर फंस सकता है। इससे बचने का सबसे अच्छा तरीका प्रत्येक धुंधलापन के लिए एक ताजा कामकाजी समाधान बनाना है और 40 जाल μm और 0.22 μm फ़िल्टर दोनों का उपयोग करना है। फिर, रॉकर के साथ आंदोलन बनाए रखने और धुंधला होने के समय को 10 मिनट तक सीमित करने से किसी भी कण को बसने से रोकने में मदद मिलेगी। यदि समस्या बनी रहती है, तो एक ताजा ओआरओ स्टॉक समाधान बनाने में मदद मिल सकती है। यदि कुछ कलाकृति विकोशिकीय मांसपेशियों की सतह से चिपकी रहती है, तो इस कलाकृति को हटाने के लिए एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप, फोर्सप्स और सर्जिकल कैंची का उपयोग किया जा सकता है। कलाकृतियों को खत्म करने में विफल रहने से मांसपेशियों की छवि की गुणवत्ता प्रभावित होगी और ओडी रीडिंग की तैयारी में लिपिड निष्कर्षण भाग के दौरान आईमैट सामग्री को अधिक महत्व दिया जाएगा।
कुल मिलाकर, यह तकनीक सरल है और कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ को देखने और मात्रा निर्धारित करने के लिए सोने के मानक तरीकों पर कई फायदे प्रदान करती है। सीटी, एमआरआई और यूएस जैसी गैर-आक्रामक तकनीकें, जो मनुष्यों में और कभी-कभी पशु मॉडल में बड़े पैमाने पर उपयोग की जाती हैं, में सीमित स्थानिक संकल्प होता है और मांसपेशियों के तंतुओं से लिपिड बूंदों को अलग करने में असमर्थ होते हैं। इस प्रकार, मध्यवर्ती संकेत तीव्रता के एक पिक्सेल या वोक्सेल को “मांसपेशी” या “वसा” के रूप में सौंपा जाता है, जबकि वास्तविकता में यह संभवतः मायोफाइबर और एडिपोसाइट्स का मिश्रण है। आमतौर पर, पशु मांसपेशियों में फैटी घुसपैठ का मूल्यांकन हिस्टोलॉजी द्वारा किया जाता है, अक्सर मांसपेशी क्रायोसेक्शन में ओआरओ द्वारा। हालांकि, यह आमतौर पर केवल एक प्रतिनिधि खंड में किया जाता है और अनुभाग पर लिपिड स्कैटर के कारण मात्रा निर्धारित करना मुश्किल होता है। इसके विपरीत, एक संपूर्ण विकोशिकीय मांसपेशी का ओआरओ धुंधला पन बरकरार आकृति विज्ञान के समान लागत और प्रयास के साथ आईएमएटी का व्यापक मूल्यांकन प्रदान करता है। इसके अलावा, विज़ुअलाइज़ेशन को बढ़ाने के अलावा, डीसेल्युलराइजेशन का ओआरओ धुंधला लिपिड निष्कर्षण द्वारा फैटी घुसपैठ की मात्रा का ठहराव करने में सक्षम बनाता है। फैटी घुसपैठ की विशेषताओं में गहरी गोता लगाने के लिए, एक फ्लोरोसेंट दाग, बीओडीआईपीवाई, का उपयोग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में किया जा सकता है। यह 3 डी परिदृश्य को मैप करने के लिए व्यक्तिगत आईमैट लिपिड बूंदों के पुनर्निर्माण को सक्षम बनाता है, जो हिस्टोलॉजी के साथ संभव नहीं है जब तक कि मांसपेशियों की लंबाई पर वर्गों का विश्लेषण नहीं किया जाता है। जबकि एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप मानक प्रयोगशाला उपकरण नहीं है, यह छोटे पशु एमआरआई या सीटी की तुलना में विश्वविद्यालय या उद्योग सेटिंग में सुलभ होने की अधिक संभावना है। इसके अलावा, इस प्रक्रिया का अधिकांश हिस्सा स्वचालित हो सकता है, अनुक्रमिक हिस्टोलॉजी की तुलना में समय लागत को कम करता है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर सेटिंग्स को अनुकूलित करना बीओडीआईपीवाई धुंधला होने के लिए एक अतिरिक्त विचार है। ये प्रत्येक माइक्रोस्कोप के लिए अद्वितीय हैं। महत्वपूर्ण मूल्य लेजर तीव्रता है, जो मांसपेशियों की दूर की सतह पर लिपिड बूंदों का पता लगाने के लिए पर्याप्त होना चाहिए, जबकि पास की तरफ लिपिड बूंदों से संकेत को संतृप्त नहीं करता है। इस वजह से, यह सुझाव दिया जाता है कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ बीओडीआईपीवाई धुंधला का उपयोग करना ईडीएल या डायाफ्राम सहित पतली मांसपेशियों पर सबसे उपयुक्त है।
इस दृष्टिकोण की कई सीमाओं पर चर्चा की आवश्यकता है। सबसे पहले, जबकि यह अनुमान लगाया गया है कि इस तकनीक में यहां प्रस्तुत चूहों में चोट मॉडल (कार्डियोटॉक्सिन और ग्लिसरॉल) से परे व्यापक प्रयोज्यता है, नए अनुप्रयोगों (जैसे, एमडीएक्स मॉडल) को अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है, क्योंकि मांसपेशियों का आकार और संरचना (जैसे, फाइब्रोसिस) डीसेलुलराइजेशन को प्रभावित कर सकती है, जिससे एसडीएस एकाग्रता या इनक्यूबेशन गुना वृद्धि की आवश्यकता होती है। परिवर्तित मांसपेशी द्रव्यमान के साथ अन्य रोग मॉडल को भी अधिक सार्थक परिणाम उपाय प्रदान करने के लिए मांसपेशियों की मात्रा के सापेक्ष लिपिड की पूर्ण मात्रा या लिपिड के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए फैटी घुसपैठ के पूर्ण और सामान्यीकृत (मांसपेशी द्रव्यमान के लिए) मैट्रिक्स दोनों के विश्लेषण की आवश्यकता होगी। इसके अलावा, इस तकनीक को मोटे तौर पर बड़े पशु मॉडल और मानव बायोप्सी पर लागू होने का अनुमान है, लेकिन इसके लिए प्रत्येक नए अनुप्रयोग के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। दूसरा, इस रणनीति में, पूरी मांसपेशी को इस परख के लिए समर्पित किया जाना चाहिए और इसका उपयोग किसी अन्य रोग संबंधी विशेषता का आकलन करने के लिए नहीं किया जा सकता है। आईमैट में अनुदैर्ध्य परिवर्तनों का आकलन करने का लक्ष्य रखने वाले अध्ययनों को गैर-आक्रामक इमेजिंग तकनीकों और अध्ययनों के साथ बेहतर सेवा दी जाती है, जिनके प्राथमिक उद्देश्य के लिए अन्य उद्देश्यों (हिस्टोलॉजी, मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन, वेस्टर्न ब्लोटिंग) के लिए मांसपेशियों की आवश्यकता होती है, हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन द्वारा बेहतर सेवा की जाती है, क्योंकि जमे हुए मांसपेशियों के शेष हिस्से को अन्य परखों को आवंटित किया जा सकता है। हालांकि, यह परख विवो परीक्षण में जोड़ी के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, जैसे ट्रेडमिल रनिंग, या एक्स विवो सिकुड़ा हुआ परीक्षण, क्योंकि ये उपाय डीसेलुलराइजेशन44 से पहले किए जा सकते हैं। तीसरा, हालांकि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ बीओडीआईपीवाई दाग का उपयोग लिपिड बूंदों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन विज़ुअलाइज़ेशन और परिमाणीकरण प्रदान करता है, यह निर्णायक रूप से लिपिड बूंदों को व्यक्तिगत एडिपोसाइट्स के रूप में पहचान नहीं सकता है, क्योंकि कोशिका झिल्ली को हटा दिया जाता है और अंतर्जात एडिपोसाइट्स प्रोटीन खो जाते हैं। मल्टीओकुलर एडिपोसाइट्स, अपरिपक्व एडिपोसाइट्स या “ब्राउन / बेज” फेनोटाइप का प्रतिनिधित्व करते हैं, को कई लिपिड बूंदों के रूप में पहचाना जा सकता है। अंत में, प्रोटोकॉल पहले जमे हुए मांसपेशियों पर अच्छी तरह से काम नहीं करता है। ये सीमाएं शायद मानव बायोप्सी के लिए सबसे गहरा हैं, क्योंकि जबकि पूरे बायोप्सी को डीसेल्युलर किया जा सकता है, बायोप्सी में आईमैट का स्थानिक वितरण हिस्टोलॉजिकल स्लाइस की तुलना में पूरी मांसपेशी का अधिक प्रतिनिधि होने की संभावना नहीं है। हालांकि, चूंकि यह तकनीक अनफ्रोजन बायोप्सी हैंडलिंग स्थितियों (जैसे, पीबीएस में बर्फ पर घंटे) के लिए अपेक्षाकृत असंवेदनशील है, बायोप्सी को बाद में विभिन्न परखों के लिए विभाजित किया जा सकता है, जिसमें डीसेलुलराइजेशन के लिए एक हिस्सा शामिल है, जो व्यक्तिगत लिपिड बूंदों का बेहतर रिज़ॉल्यूशन प्रदान करेगा।
अंत में, कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक नई विधि विकसित की गई है, जो विकोशिकीय संरचनाओं के बरकरार लिपिड को धुंधला और इमेजिंग करके विकसित की गई है। यह पद्धति स्वर्ण-मानक दृष्टिकोणों पर सुधार प्रदान करती है, जिसमें यह मांसपेशियों के भीतर त्रि-आयामी फैटी घुसपैठ की व्यापक इमेजिंग और ओआरओ धुंधला होने के साथ त्वरित, सस्ते परिमाणीकरण को सक्षम बनाता है। अधिक विस्तृत उपायों के लिए, एक दूसरा लिपिड-घुलनशील बीओडीआईपीवाई दाग लिपिड बूंद संख्या, मात्रा और वितरण पैटर्न का अधिक विस्तृत परिमाणीकरण प्रदान करता है, जैसा कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया गया है। साथ में, ये उपाय शोधकर्ताओं को नमूना या महंगी नॉनइनवेसिव इमेजिंग के बिना व्यक्तिगत लिपिड बूंदों के स्तर पर कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ को ठीक से मापने का एक तरीका प्रदान करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को जीएएम के R01AR075773 द्वारा समर्थित किया गया था।
0.22 µm Syringe Filter | Fisher Scientific | SLGP033RS | |
1 mL LuerLock Syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
12 mm Coverslips | Fisher Scientific | 12545F | |
12 well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
24 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
2-Propanol (Isopropanol) | Sigma Aldrich | I9516 | 0.5 mg/mL stock solution can be stored at room temperature for 1 month. Working solution must be made fresh. |
37% Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 8187081000 | |
40 µm Mesh Filter | Fisher Scientific | 87711 | |
6 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
96 well plates | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
BODIPY 493/503 | Fisher Scientific | D-3922 | |
C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
Confocal Imaging Dish | VWR | 734-2905 | |
Confocal Microscope | Leica | TCS SPEII | |
Dissecting/stereo Microscope | Zeiss | 4107009123001000 | |
Dissection scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 033361.K2 | |
ImageJ | NIH | ||
Matlab | Mathworks | ||
Oil Red O Powder | Sigma Aldrich | O0625 | |
Plate reader | Bio-tek | Synergy II | |
Rocker/Shaker | Reliable Scientific | 55D | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | 1% Solution can be stored at room temperature for 1 month |
Transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119D | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 |