Görüntüleme platformu “The Lifespan Machine”, büyük popülasyonların yaşam boyu gözlemini otomatikleştirir. Yaşam süresi, stres direnci, patogenez ve davranışsal yaşlanma testlerini gerçekleştirmek için gereken adımları gösteriyoruz. Verilerin kalitesi ve kapsamı, araştırmacıların biyolojik ve çevresel varyasyonların varlığına rağmen yaşlanmaya yönelik müdahaleleri incelemelerine olanak tanır.
Sabit bir ortamda tutulan genetik olarak özdeş hayvanlar, incelenen tüm organizmalarda korunan yaşlanmanın genetik olmayan, stokastik büyük bir yönünü yansıtan geniş bir yaşam dağılımı sergiler. Bu stokastik bileşen, yaşlanmayı anlamak ve yaşam süresini uzatan veya sağlığı iyileştiren başarılı müdahaleleri belirlemek için araştırmacıların aynı anda büyük deney hayvanı popülasyonlarını izlemesi gerektiği anlamına gelir. Geleneksel manuel ölüm puanlaması, büyük ölçekli hipotez testi için gereken verimi ve ölçeği sınırlayarak, yüksek verimli yaşam süresi tahlilleri için otomatik yöntemlerin geliştirilmesine yol açar. Lifespan Machine (LSM), nematodların ömür boyu izlenmesi için modifiye edilmiş düz yataklı tarayıcıları özel görüntü işleme ve veri doğrulama yazılımıyla birleştiren yüksek verimli bir görüntüleme platformudur. Platform, büyük hayvan popülasyonlarından daha önce görülmemiş bir ölçekte ve deneyimli araştırmacılar tarafından gerçekleştirilen manuel tahlillere eşit istatistiksel bir hassasiyet ve doğrulukta yüksek oranda zamansal olarak çözülmüş yaşam süresi verileri üreterek büyük bir teknik ilerleme teşkil ediyor. Son zamanlarda, LSM, yaşlanma sırasında gözlenen davranışsal ve morfolojik değişiklikleri ölçmek ve bunları yaşam süresiyle ilişkilendirmek için daha da geliştirilmiştir. Burada, LSM kullanarak otomatik bir yaşam süresi denemesinin nasıl planlanacağını, çalıştırılacağını ve analiz edileceğini açıklıyoruz. Davranışsal verilerin ve yüksek kaliteli hayatta kalma eğrilerinin başarılı bir şekilde toplanması için gereken kritik adımları daha da vurguluyoruz.
Yaşlanma, bir organizmanın fizyolojik işlevinde bir azalma ile karakterize edilen karmaşık, çok yönlü bir süreçtir ve bu da zamanla hastalık ve ölüm riskinde bir artışa yol açar1. Doğumdan veya yetişkinliğin başlangıcından ölüme kadar geçen süre olarak ölçülen yaşam süresi, yaşlanmanın kesin bir sonucunu2 ve popülasyonlar arasındaki nispi yaşlanma oranını ölçmek için dolaylı ancak titiz bir şekilde nicel bir vekilsağlar 3. Yaşlanma çalışmaları, bir müdahaleye maruz kalan bir popülasyon ile maruz kalmayan bir kontrol grubu arasındaki sonuçları karşılaştırmak için klinik çalışmalara benzer şekilde genellikle doğru yaşam süresi ölçümlerine bağlıdır. Ne yazık ki, tekrarlanabilirlik sorunları, bazen istatistiksel olarak yetersiz deneyler4 ve çoğu zaman yaşam süresi tahlillerinin ortamdaki ince değişikliklere karşı doğal duyarlılığı nedeniyle yaşlanma araştırmalarınahakimdir 5. Sağlam deneyler, büyük popülasyonların birden çok kopyasını gerektirir ve bu süreç özellikle otomasyon6 tarafından sunulan deneysel ölçeklenebilirlikten yararlanır.
Yaşam boyu tahlillerin titiz talepleri, yaşlanma sürecinin kendisinin öngörülemezliğinden kaynaklanmaktadır. Aynı ortamlarda barındırılan izogenik bireyler, farklı ölüm zamanları ve fizyolojik düşüş oranları7 sergilerler, bu da yaşam süresinin yüksek derecede stokastiklikiçerdiğini düşündürür 7,8. Bu nedenle, ortalama veya maksimum yaşam süresindeki değişiklikler gibi yaşlanma sürecindeki nicel değişiklikleri ölçmek ve bireysel değişkenlikten kaynaklanan önyargıların üstesinden gelmek için büyük popülasyonlar gereklidir. Ek olarak, yüksek verimli yaşam süresi tahlilleri için bir kapasite, hayatta kalma eğrisi şekilleri ve yaşlanma dinamiklerinin modelleri ile ilgili çalışmaları desteklemek için çok önemlidir9.
Nematod Caenorhabditis elegans, kısa ömrü, genetik izlenebilirliği ve hızlı üretim süresi nedeniyle yaşlanma araştırmaları için paha biçilmez bir modeldir ve bu da yüksek verimli yaşlanma ve yaşam süresi deneyleri için uygunluğunun altını çizer. Geleneksel olarak, C’deki ömür. Elegans, zaman içinde yaklaşık 50-100 hayvandan oluşan senkronize, küçük bir popülasyonu katı ortamda takip ederek ve bireysel ölümlerin zamanını yazarak ölçülmüştür. Hayvanlar yaşlandıkça ve hareket kabiliyetini kaybettikçe, ölüm zamanlarını manuel olarak puanlamak, hayvanları ayrı ayrı dürtmeyi ve baş veya kuyruğun küçük hareketlerini kontrol etmeyi gerektirir. Bu genellikle sıkıcı ve zahmetli bir süreçtir, ancak hızlandırmak için çaba sarf edilmiştir 10,11,12. Daha da önemlisi, yavaş deneysel boru hatları, yaşlanma ve test edilen müdahalelerin etkinliği konusundaki anlayışımızdaki ilerlemeyi engellemektedir.
Kantitatif veriler için yaşlanma araştırmalarının taleplerini karşılamak için, mikroakışkan odalardan düz yataklı tarayıcılara kadar dikkate değer bir dizi yaklaşım da dahil olmak üzere veri toplamayı otomatikleştirmek için birçok teknoloji geliştirilmiştir 13,14,15,16,17,18. LSM, kullanıcıların otomatik analizleri doğrulamasına, düzeltmesine ve iyileştirmesine olanak tanıyan kapsamlı bir yazılım paketi ile birlikte dikkatli ekipman kalibrasyon protokollerinin geliştirilmesiyle elde edilen son derece hassas ve doğru kullanım ömrü verilerinin toplanması için kapsamlı optimizasyonuyla diğer yöntemlerden farklıdır13. Yazılım, prensip olarak, çeşitli görüntüleme yöntemlerine uygulanabilse de, pratikte çoğu kullanıcı, kullanım ömrü üzerindeki büyük etkileri nedeniyle kritik öneme sahip faktörler olan ortam sıcaklığı ve nemi üzerinde ince ayarlı kontrole izin verecek şekilde modifiye edilmiş düz yataklı tarayıcılar kullanır19. LSM, çevresel koşullara ve genotipe bağlı olarak günlerden aylara kadar değişen aralıklarla her 20 dakikada bir nematodların görüntülerini alır. Üretilen veriler, manuel tahlillerden elde edilen verilere kıyasla çok daha yüksek zamansal çözünürlüğe sahiptir ve toplanan görüntüler, kullanım ömrü boyunca nematod konumunun kalıcı bir görsel kaydını sağlar. Makine öğrenimi yöntemleri kullanılarak, ölüm süreleri her bireye otomatik olarak atanır. Bu sonuçlar, “Worm Browser” adı verilen bir istemci yazılımı kullanılarak hızlı ve manuel olarak doğrulanabilir. Donanım ve yazılımının bir sonucu olarak, LSM, azaltılmış iş yükü ve daha yüksek ölçeklenebilirlik avantajı ile deneyimli araştırmacıların elindeki manuel ölüm puanlamasından istatistiksel olarak ayırt edilemeyen hayatta kalma eğrileri üretebilir13.
LSM’nin en son sürümü, nematodun yaşamı boyunca morfolojik ve davranışsal verileri toplayarak ve her bireyin ömrü ile birlikte raporlayarak davranışsal yaşlanmanın incelenmesine de olanak tanır. Özellikle, LSM, her bir hayvanın güçlü hareket bırakma zamanını (VMC) yakalar, bu genellikle bir bireyin yaşam süresinden farklı olarak “sağlık süresini” ölçmek için kullanılan bir dönüm noktasıdır. LSM, yaşam süresi ve davranışsal yaşlanma verilerini aynı anda toplayarak, yaşlanmanın farklı fenotipik sonuçları üzerinde farklı etkileri olabilecek müdahalelerin incelenmesini destekler20. Vücut hareketi veya faringeal pompalama21, doku bütünlüğü22 ve hareket hızı veya uyaran kaynaklı dönme17 gibi davranışsal yaşlanmayı incelemek için çeşitli makroskopik olarak gözlemlenebilir fenotipler kullanılabilir. Farklı yaşlanma fenotipleri arasındaki karşılaştırmalar, yaşlanma süreçlerinin nedensel yapısının analizlerini destekleyebilir. Örneğin, VMC ve yaşam süresi arasındaki karşılaştırma son zamanlarda C. elegans23’te iki farklı yaşlanma sürecini karakterize etmek için kullanılmıştır.
Başlangıçta C. elegans’ın ömrünü ölçmek için geliştirilmiş olsa da, LSM, C de dahil olmak üzere bir dizi nematod türünden hayatta kalma ve davranışsal verilerin toplanmasını destekler. briggsae, C. tropikal, C. japonica, C. brenneri ve P. Pasifik23. Teknoloji, biyolojik ve çevresel müdahalelerin yaşam süresi, stres direnci ve patojen direnci üzerindeki etkisinin incelenmesini kolaylaştırır ve RNA girişiminin hedefli tahlilleri veya oksin ile indüklenebilir protein bozunma sistemleri gibi deneysel araçlarla birleştirilebilir. Bugüne kadar bilimsel literatürde çok çeşitli uygulamalar için kullanılmıştır 6,24,25,26,27,28,29,30.
Burada, deney düzeneğinin ilk aşamalarından elde edilen hayatta kalma eğrilerinin çıktısına kadar, agar plakaları kullanarak bir Yaşam Süresi Makinesi deneyi gerçekleştirmek için adım adım bir protokolün ana hatlarını çiziyoruz. LSM’nin ayırt edici bir özelliği, çabanın yüksek oranda önden yüklemeli olmasıdır, yani araştırmacının zamanının çoğu deney kurulumu sırasında ve küçük bir dereceye kadar görüntü sonrası elde etme sırasında harcanır. Veri toplama, deneyin tüm süresi boyunca tamamen otomatiktir ve araştırmacının “eller serbest” bir deneyim yaşamasını sağlar. Burada açıklanan adımlar, birçok farklı sağkalım testi türü arasında ortak tutulur – aynı deney düzeneği yaşam süresi, termotolerans, oksidatif stres ve patogenez testleri için gerçekleştirilir. Temsili sonuçlar bölümünde, analiz hattının etkinliğini göstermek ve görüntü analizi sırasındaki en önemli adımları vurgulamak için yakın zamanda yayınlanan bir makaleden elde edilen verilerin bir alt kümesini tartışıyoruz23.
Burada, Lifespan Machine’in en son sürümünü kullanarak bir deney yapmak için ayrıntılı, erişilebilir bir protokol sunuyoruz. İyi çözülmüş hayatta kalma eğrileri elde etmek için kritik adımın, görüntü sonrası elde etme sırasında solucan olmayan nesnelerin manuel olarak dışlanması olduğunu gösterdik. Manuel ölüm zamanı açıklaması, hayatta kalma eğrilerinin genel şekli üzerinde küçük bir etkiye sahiptir ve tam otomatik ölüm zamanı tahmininin manuel açıklama olmadan bile verimli…
The authors have nothing to disclose.
Julian Ceron ve Jeremy Vicencio’ya (IDIBELL Barcelona) rpb-2(cer135) alelini ürettikleri için teşekkür ederiz. Bu proje, Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı (Hibe Sözleşmesi No. 852201) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC), İspanya Ekonomi, Sanayi ve Rekabet Edebilirlik Bakanlığı (MEIC) tarafından EMBL ortaklığına, Centro de Excelencia Severo Ochoa (CEX2020-001049-S, MCIN/AEI /10.13039/501100011033), CERCA Programı/Generalitat de Catalunya, MEIC Excelencia ödülü BFU2017-88615-P, ve Glenn Tıbbi Araştırma Vakfı’ndan bir ödül.
1-Naphtaleneacetic acid (Auxin) | Sigma | N0640 | Solubilize Auxin in 1M potassium hydroxide and add into molten agar |
5-fluoro-2-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | 27.5 μg/mL of FUDR was used to eliminate progeny from populations on UV-inactivated bacteria |
Glass cleaner | Kristal-M | QB-KRISTAL-M125ml | |
Hydrophobic anti-fog glass treatment | Rain-X Scheibenreiniger | C. 059140 | |
Rubber matt | Local crafstman | Cut on a high-strength EPDM rubber sheet stock | |
Scanner glass | Local hardware supplier | 9" x 11.5" inch glass sheet | |
Scanner plates | Life Sciences | 351006 | 50 mm x 9 mm, polystyrene petri dish |
USB Reference Thermometer | USB Brando | ULIFE055500 | For calibrating temperature of scanners |