Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’utilisation d’un test rapporteur à base de luciférase dans un format de criblage semi-automatisé à haut débit.
De plus en plus de preuves ont montré qu’un flux autophagique élevé est lié à la progression tumorale et à la résistance au traitement anticancéreux. Le dosage des protéines d’autophagie individuelles est une condition préalable aux stratégies thérapeutiques ciblant cette voie. Il a été démontré que l’inhibition de la protéase de l’autophagie ATG4B augmente la survie globale, ce qui suggère que l’ATG4B pourrait être une cible médicamenteuse potentielle pour le traitement du cancer. Notre laboratoire a mis au point un test sélectif à base de luciférase pour le suivi de l’activité de l’ATG4B dans les cellules. Pour ce test, le substrat d’ATG4B, LC3B, est marqué à l’extrémité C avec une luciférase sécrétée du copépode marin Gaussia princeps (GLUC). Ce rapporteur est lié au cytosquelette d’actine, le maintenant ainsi dans le cytoplasme des cellules lorsqu’il n’est pas clivé. Le clivage médié par l’ATG4B entraîne la libération de GLUC par sécrétion non conventionnelle, qui peut ensuite être surveillée en récoltant des surnageants de culture cellulaire en tant que corrélat de l’activité cellulaire de l’ATG4B. Cet article présente l’adaptation de ce test à base de luciférase au criblage automatisé à haut débit. Nous décrivons le flux de travail et l’optimisation pour une analyse exemplaire à haut débit de l’activité cellulaire ATG4B.
L’autophagie est un processus métabolique conservé qui permet aux cellules de maintenir l’homéostasie intracellulaire et de répondre au stress en dégradant le contenu cellulaire vieilli, défectueux ou inutile via les lysosomes 1,2,3. Dans certaines conditions physiopathologiques, ce processus agit comme une réponse cellulaire cruciale à la privation de nutriments et d’oxygène, ce qui se traduit par le recyclage des nutriments et des lipides, permettant aux cellules de s’adapter à leurs besoins métaboliques 2,3,4. L’autophagie a également été identifiée comme une réponse cellulaire au stress liée à plusieurs maladies, telles que les troubles neurodégénératifs, les infections pathogènes et divers types de cancer. La fonction de l’autophagie dans le cancer est complexe et dépend du type, du stade et de l’état de la tumeur. Il peut supprimer la tumorigenèse par dégradation autophagique des cellules endommagées, mais peut également favoriser la survie des tumeurs avancées en améliorant la survie des cellules dans des conditions stressantes, telles que l’hypoxie, la privation de nutriments et les dommages cytotoxiques 2,4,5,6.
Plusieurs études ont montré que l’inhibition de l’autophagie offre un avantage en tant que stratégie anticancéreuse. Ainsi, l’inhibition d’étapes critiques, telles que la formation de l’autophagosome ou sa fusion avec le lysosome, pourrait être une méthode efficace pour le contrôle du cancer 2,4,5,6. De plus en plus de preuves ont montré que l’ATG4B est impliqué dans certaines conditions pathologiques, et il a attiré l’attention en tant que cible anticancéreuse potentielle 2,3,4. Par exemple, il a été observé que les cellules cancéreuses colorectales et les cellules cancéreuses du sein positives pour le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2) avaient des niveaux d’expression d’ATG4B significativement plus élevés que les cellules normales adjacentes 2,4. Dans les cellules cancéreuses de la prostate, l’inhibition de l’ATG4B a entraîné une susceptibilité spécifique de la lignée cellulaire à la chimiothérapie et à la radiothérapie7. Récemment, des preuves solides ont émergé que l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est particulièrement vulnérable à l’inhibition de l’ATG4B. Par exemple, dans un modèle murin génétiquement modifié, il a été démontré que la perte intermittente de la fonction ATG4B réduit la croissance tumorale de la PDAC et augmente la survie 3,4. Dans l’ensemble, l’ATG4B est fortement surexprimé dans certains types de cancer, est lié à la progression de la tumeur et est lié à la résistance au traitement anticancéreux 2,4,8.
Les protéases de cystéine ATG4 chez les mammifères ont quatre membres de la famille, ATG4A-ATG4D. Ces protéines présentent une certaine sélectivité vis-à-vis de la famille des protéines LC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 et peuvent avoir des fonctions supplémentaires non liées à leur activité protéase12,13. De plus, l’ATG4 fonctionne dans la régulation d’un nouveau type de modification post-traductionnelle, l’ATG8-ylation des protéines11,12. Alors que l’ATG4B et son substrat principal LC3B sont les plus étudiés, une image émerge qui suggère un rôle complexe pour chaque membre de la sous-famille dans la régulation des processus autophagiques et non autophagiques. Ceci est en outre corroboré par un réseau complexe de modifications post-traductionnelles qui régulent l’activité de l’ATG4B via la phosphorylation, l’acétylation, la glycosylation et la nitrosylation 9,10,11,12,13.
Plusieurs inhibiteurs connus de l’ATG4B ont été publiés 2,4,14,15. Bien qu’ils conviennent comme outils de recherche, leur profil pharmacodynamique, leur sélectivité ou leur puissance les ont encore empêchés de se développer en tant que candidats précliniques 4,16. Dans l’ensemble, il est urgent d’identifier des composés plus puissants et plus sélectifs. Souvent, les composés sont de bons inhibiteurs biochimiques de la fonction des protéines, mais leur efficacité dans les tests cellulaires est médiocre. Il existe plusieurs tests pour surveiller l’activité de l’ATG4B, y compris des méthodes biochimiques et des tests cellulaires4. Nous avons précédemment développé un test simple, basé sur la luminescence et à haut débit, pour surveiller l’activité de l’ATG4B dans les cellules 8,17. Ce test utilise une protéine luciférase de Gaussia princeps (GLUC) qui est stable et active dans le milieu extracellulaire et peut être libérée de manière inductive par les cellules en réponse à l’activité protéolytique ATG4B18,19.
Dans cette construction rapporteure, dNGLUC est lié au cytosquelette d’actine des cellules. Un agent de liaison spécifique de la protéase peut être introduit entre l’ancre β-actine et le dNGLUC, ce qui rend la sécrétion dépendante du clivage du liant. Nous avons utilisé le cadre de lecture ouvert sur toute la longueur de la LC3B entre la β-actine et le dNGLUC, afin de pouvoir surveiller le clivage de la LC3B17,18,19. Bien que le mécanisme de sécrétion de dNGLUC soit mal compris, il est spécifique pour le suivi de l’activité de l’ATG4B, ne dépend pas de l’autophagie globale telle qu’elle se produit dans les cellules knock-out de l’ATG5, et est médié par des mécanismes non conventionnels qui ne nécessitent pas de peptide signal classique 4,18,19. Nous avons utilisé avec succès ce rapporteur pour cribler de petites molécules et des banques de siRNA, et avons identifié de nouveaux régulateurs de l’activité de l’ATG4B, tels que les protéines kinasesAkt 8. Cet article décrit un protocole détaillé pour l’utilisation de ce rapporteur de luciférase dans un format de criblage semi-automatisé à haut débit.
Ce protocole décrit un test de gène rapporteur basé sur des cellules pour l’identification d’inhibiteurs de l’ATG4B. L’identification des hits primaires est basée sur l’activité de la luciférase lors du traitement des cellules exprimant le cadre de lecture ouvert sur toute la longueur de la LC3B entre la β-actine et le dNGLUC. Certains avantages de ce test sont qu’il est sensible, hautement quantitatif et non invasif, car il peut détecter le dNGLUC sans lyser les cellules. Cet article présente un pro…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le financement de base du Conseil de la recherche médicale du Royaume-Uni pour la subvention d’unité universitaire MRC-UCL Ref MC_U12266B, la subvention de la plateforme de démence MRC UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (référence de subvention 2018RIF_15) et le programme de soutien à l’accélération thérapeutique de l’UCL, soutenu par le financement de MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. Le plasmide codant pour l’ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) a été obtenu auprès du Dr Robin Ketteler (Département de médecine humaine, Faculté de médecine de Berlin).
50 µL Disposable Tips – Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
Milli-Q water | deionized water | ||
Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |