Zellbasiertes Wirkstoff-Screening auf Inhibitoren der Autophagie-verwandten 4B-Cystein-Peptidase
Summary
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines Luciferase-basierten Reporter-Assays in einem halbautomatischen Hochdurchsatz-Screening-Format.
Abstract
Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass ein hoher autophagischer Fluss mit dem Fortschreiten des Tumors und der Resistenz gegen die Krebstherapie zusammenhängt. Der Nachweis einzelner Autophagie-Proteine ist eine Voraussetzung für therapeutische Strategien, die auf diesen Signalweg abzielen. Es wurde gezeigt, dass die Hemmung der Autophagie-Protease ATG4B das Gesamtüberleben erhöht, was darauf hindeutet, dass ATG4B ein potenzielles Angriffsziel für die Krebstherapie sein könnte. Unser Labor hat einen selektiven Luciferase-basierten Assay zur Überwachung der ATG4B-Aktivität in Zellen entwickelt. Für diesen Assay wird das Substrat von ATG4B, LC3B, am C-Terminus mit einer sekretierbaren Luciferase aus dem marinen Ruderfußkrebs Gaussia princeps (GLUC) markiert. Dieser Reporter ist mit dem Aktin-Zytoskelett verbunden, so dass es im Zytoplasma der Zellen verbleibt, wenn es unverschlossen ist. Die ATG4B-vermittelte Spaltung führt zur Freisetzung von GLUC durch unkonventionelle Sekretion, die dann durch die Ernte von Überständen aus Zellkulturen als Korrelat der zellulären ATG4B-Aktivität überwacht werden kann. In diesem Artikel wird die Anpassung dieses Luciferase-basierten Assays an das automatisierte Hochdurchsatz-Screening vorgestellt. Wir beschreiben den Workflow und die Optimierung für eine beispielhafte Hochdurchsatzanalyse der zellulären ATG4B-Aktivität.
Introduction
Autophagie ist ein konservierter Stoffwechselprozess, der es den Zellen ermöglicht, die intrazelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten und auf Stress zu reagieren, indem sie gealterte, defekte oder unnötige Zellinhalte über die Lysosomen abbauen 1,2,3. Unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen fungiert dieser Prozess als entscheidende zelluläre Reaktion auf Nährstoff- und Sauerstoffmangel, was zu recycelten Nährstoffen und Lipiden führt, die es den Zellen ermöglichen, sich an ihre Stoffwechselbedürfnisse anzupassen 2,3,4. Autophagie wurde auch als zelluläre Stressreaktion im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten identifiziert, wie z. B. neurodegenerativen Erkrankungen, Infektionen mit Krankheitserregern und verschiedenen Krebsarten. Die Funktion der Autophagie bei Krebs ist komplex und hängt von der Art, dem Stadium und dem Status des Tumors ab. Es kann die Tumorentstehung durch autophagischen Abbau geschädigter Zellen unterdrücken, aber auch das Überleben fortgeschrittener Tumore fördern, indem es das Überleben der Zellen unter Stressbedingungen wie Hypoxie, Nährstoffmangel und zytotoxischen Schäden verbessert 2,4,5,6.
Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Hemmung der Autophagie einen Nutzen als Antikrebsstrategie bietet. Daher könnte die Hemmung kritischer Schritte, wie z.B. der Autophagosomenbildung oder deren Fusion mit dem Lysosom, eine wirksame Methode zur Krebskontrolle sein 2,4,5,6. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass ATG4B an bestimmten pathologischen Zuständen beteiligt ist, und es hat als potenzielles Ziel gegen Krebs Aufmerksamkeit erregt 2,3,4. So wurde beispielsweise beobachtet, dass kolorektale Krebszellen und humane epidermale Wachstumsfaktorrezeptor 2 (HER2)-positive Brustkrebszellen signifikant höhere ATG4B-Expressionsniveaus aufwiesen als benachbarte normale Zellen 2,4. In Prostatakarzinomzellen führte die Hemmung von ATG4B zu einer zelllinienspezifischen Empfindlichkeit gegenüber Chemo- und Strahlentherapie7. In jüngster Zeit gibt es starke Hinweise darauf, dass das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) besonders anfällig für eine ATG4B-Hemmung ist. In einem gentechnisch veränderten Mausmodell konnte beispielsweise gezeigt werden, dass ein intermittierender Verlust der ATG4B-Funktion das Wachstum von PDAC-Tumoren reduziert und das Überleben verlängert 3,4. Insgesamt ist ATG4B bei einigen Krebsarten stark überexprimiert, hängt mit dem Fortschreiten des Tumors zusammen und ist mit der Resistenz gegen Krebstherapien verbunden 2,4,8.
Die ATG4-Cystein-Proteasen in Säugetieren haben vier Familienmitglieder, ATG4A-ATG4D. Diese Proteine weisen eine gewisse Zielselektivität gegenüber der LC3/GABARAP (ATG8)-Proteinfamilie 9,10,11 auf und können zusätzliche Funktionen haben, die nicht mit ihrer Proteaseaktivität verbunden sind 12,13. Darüber hinaus reguliert ATG4 eine neuartige posttranslationale Modifikation, die ATG8-Ylierung von Proteinen11,12. Während ATG4B und sein Hauptsubstrat LC3B am besten untersucht sind, zeichnet sich ein Bild ab, das auf eine komplexe Rolle jedes Mitglieds der Unterfamilie bei der Regulation autophagischer und nicht-autophagischer Prozesse hindeutet. Dies wird durch ein komplexes Netzwerk von posttranslationalen Modifikationen bestätigt, die die ATG4B-Aktivität über Phosphorylierung, Acetylierung, Glykosylierung und Nitrosylierung regulieren 9,10,11,12,13.
Mehrere bekannte ATG4B-Inhibitoren wurden veröffentlicht 2,4,14,15. Diese eignen sich zwar als Forschungsinstrumente, aber ihr pharmakodynamisches Profil, ihre Selektivität oder ihre Wirksamkeit haben sie bisher von der Entwicklung als präklinische Kandidaten ausgeschlossen 4,16. Insgesamt besteht ein dringender Bedarf, wirksamere und selektivere Verbindungen zu identifizieren. Oft sind die Verbindungen gute biochemische Inhibitoren der Proteinfunktion, aber ihre Wirksamkeit in zellbasierten Assays ist schlecht. Es gibt mehrere Assays zur Überwachung der ATG4B-Aktivität, darunter biochemische Methoden und zellbasierte Assays4. Wir haben zuvor einen einfachen, Lumineszenz-basierten Hochdurchsatz-Assay zur Überwachung der ATG4B-Aktivität in Zellen entwickelt 8,17. Dieser Assay verwendet ein Luciferase-Protein aus Gaussia princeps (GLUC), das im extrazellulären Milieu stabil und aktiv ist und als Reaktion auf die proteolytische Aktivität von ATG4B induzierbar aus Zellen freigesetzt werden kann18,19.
In diesem Reporterkonstrukt ist dNGLUC mit dem Aktin-Zytoskelett von Zellen verbunden. Ein proteasespezifischer Linker kann zwischen dem β-Aktin-Anker und dNGLUC eingeführt werden, wodurch das Sekret von der Spaltung des Linkers abhängig wird. Wir haben den offenen Leserahmen von LC3B in voller Länge zwischen β-Aktin und dNGLUC verwendet, um die LC3B-Spaltung 17,18,19 überwachen zu können. Obwohl der Sekretionsmechanismus von dNGLUC nur unzureichend verstanden ist, ist er spezifisch für die Überwachung der ATG4B-Aktivität, hängt nicht von der allgemeinen Autophagie ab, wie sie in ATG5-Knockout-Zellen auftritt, und wird durch unkonventionelle Mechanismen vermittelt, die kein klassisches Signalpeptidbenötigen 4,18,19. Wir haben diesen Reporter erfolgreich verwendet, um kleine Moleküle und siRNA-Bibliotheken zu screenen und neue Regulatoren der ATG4B-Aktivität zu identifizieren, wie z.B. die Akt-Proteinkinasen8. In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung dieses Luciferase-Reporters in einem halbautomatischen Hochdurchsatz-Screening-Format beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt einen zellbasierten Reportergen-Assay zur Identifizierung von ATG4B-Inhibitoren. Die Identifizierung von primären Treffern basiert auf der Luciferase-Aktivität bei der Behandlung von Zellen, die den offenen Leserahmen von LC3B in voller Länge zwischen β-Aktin und dNGLUC exprimieren. Einige Vorteile dieses Assays sind, dass er empfindlich, hochquantitativ und nicht-invasiv ist, da er dNGLUC nachweisen kann, ohne die Zellen zu lysieren. In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll zur G…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Kernfinanzierung des UK Medical Research Council für den MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, den MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (Grant Reference 2018RIF_15) und das UCL Therapeutic Acceleration Support Scheme unterstützt, das durch Mittel aus dem MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054 unterstützt wird. Das Plasmid, das für ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) kodiert, wurde von Dr. Robin Ketteler (Klinik für Humanmedizin, Medizinische Fakultät Berlin) gewonnen.
Materials
| 50 µL Disposable Tips – Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
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