בדיקת תרופות מבוססות תאים למעכבי אוטופגיה הקשורים לפפטידאז ציסטאין 4B
Summary
כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לשימוש בבדיקת כתב מבוססת לוציפראז בפורמט סינון חצי אוטומטי, בתפוקה גבוהה.
Abstract
עדויות הולכות וגדלות הראו כי שטף אוטופגי גבוה קשור להתקדמות הגידול ולעמידות לטיפול בסרטן. בדיקת חלבוני אוטופגיה בודדים היא תנאי מוקדם לאסטרטגיות טיפוליות המכוונות למסלול זה. עיכוב של פרוטאז אוטופגיה ATG4B הוכח כמגביר את ההישרדות הכוללת, דבר המצביע על כך ש- ATG4B יכול להיות מטרה פוטנציאלית לטיפול בסרטן. המעבדה שלנו פיתחה בדיקה סלקטיבית מבוססת לוציפראז לניטור פעילות ATG4B בתאים. עבור בדיקה זו, המצע של ATG4B, LC3B, מתויג במסוף C עם לוציפראז סודי מהקופפוד הימי Gaussia princeps (GLUC). כתב זה מקושר לשלד הציטופלזמה של האקטין ובכך שומר אותו בציטופלסמה של תאים כאשר הוא משוחרר. מחשוף בתיווך ATG4B גורם לשחרור GLUC על ידי הפרשה לא קונבנציונלית, אשר לאחר מכן ניתן לנטר על ידי קצירת supernatants מתרבית תאים כמתאם של פעילות ATG4B תאית. מאמר זה מציג את ההתאמה של בדיקה מבוססת לוציפראז זו לסינון אוטומטי בתפוקה גבוהה. אנו מתארים את זרימת העבודה והאופטימיזציה לניתוח מופתי של תפוקה גבוהה של פעילות ATG4B סלולרית.
Introduction
אוטופגיה היא תהליך מטבולי שמור המאפשר לתאים לשמור על הומאוסטזיס תוך-תאי ולהגיב ללחץ על ידי פירוק תוכן תאי מיושן, פגום או מיותר באמצעות ליזוזומים 1,2,3. בתנאים פתופיזיולוגיים מסוימים, תהליך זה פועל כתגובה תאית חיונית למחסור בחומרים מזינים ובחמצן, וכתוצאה מכך חומרים מזינים ושומנים ממוחזרים, המאפשרים לתאים להסתגל לצרכים המטבוליים שלהם 2,3,4. אוטופגיה זוהתה גם כתגובת עקה תאית הקשורה למספר מחלות, כגון הפרעות נוירודגנרטיביות, זיהום פתוגן וסוגים שונים של סרטן. תפקידה של אוטופגיה בסרטן מורכב ותלוי בסוג, בשלב ובסטטוס של הגידול. זה יכול לדכא גידולים באמצעות פירוק אוטופגי של תאים פגומים, אבל יכול גם לקדם את ההישרדות של גידולים מתקדמים על ידי שיפור הישרדות התאים במהלך תנאי עקה, כגון היפוקסיה, חסך תזונתי, נזק ציטוטוקסי 2,4,5,6.
מספר מחקרים הראו כי עיכוב אוטופגיה מספק יתרון כאסטרטגיה נגד סרטן. לפיכך, עיכוב של צעדים קריטיים, כגון היווצרות אוטופגוזום או איחוי שלה עם הליזוזום, יכול להיות שיטה יעילה לשליטה בסרטן 2,4,5,6. עדויות הולכות וגדלות הראו כי ATG4B מעורב במצבים פתולוגיים מסוימים, והוא זכה לתשומת לב כיעד פוטנציאלי נגד סרטן 2,3,4. לדוגמה, נצפה כי תאי סרטן המעי הגס והחלחולת וקולטן גורם גדילה אפידרמיס אנושי 2 (HER2) חיובי לתאי סרטן השד היו בעלי רמות ביטוי ATG4B גבוהות משמעותית מאשר תאים נורמליים סמוכים 2,4. בתאי סרטן הערמונית, עיכוב ATG4B הביא לרגישות ספציפית לקו תאים לכימותרפיה והקרנות7. לאחרונה, התגלו ראיות חזקות לכך שאדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) פגיעה במיוחד לעיכוב ATG4B. לדוגמה, במודל עכבר מהונדס גנטית, הוכח כי אובדן לסירוגין של תפקוד ATG4B מפחית את צמיחת הגידול PDAC ומגביר את הישרדות 3,4. בסך הכל, ATG4B מתבטא יתר על המידה בכמה סוגי סרטן, קשור להתקדמות הגידול, והוא קשור לעמידות לטיפול בסרטן 2,4,8.
לפרוטאזות ציסטאין ATG4 ביונקים יש ארבעה בני משפחה, ATG4A-ATG4D. חלבונים אלה מפגינים סלקטיביות מטרה מסוימת כלפי משפחת החלבוניםLC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 וייתכן שיש להם תפקידים נוספים שאינם קשורים לפעילות הפרוטאז שלהם 12,13. יתר על כן, ATG4 מתפקד בוויסות סוג חדש של שינוי לאחר תרגום, ATG8-ylation של חלבונים11,12. בעוד ATG4B והמצע העיקרי שלו LC3B הם הנחקרים ביותר, מתגבשת תמונה המצביעה על תפקיד מורכב עבור כל תת-משפחה בוויסות תהליכים אוטופגיים ולא אוטופגיים. הדבר מאושש עוד יותר על ידי רשת מורכבת של שינויים פוסט-תרגומיים המווסתים את פעילות ATG4B באמצעות זרחון, אצטילציה, גליקוזילציה וניטרוסילציה 9,10,11,12,13.
מספר מעכבי ATG4B ידועים פורסמו 2,4,14,15. בעוד אלה מתאימים ככלי מחקר, הפרופיל הפרמקודינמי שלהם, סלקטיביות או עוצמה עדיין מנעו מהם לפתח כמועמדים פרה-קליניים 4,16. באופן כללי, יש צורך דחוף לזהות תרכובות חזקות וסלקטיביות יותר. לעתים קרובות, התרכובות הן מעכבות ביוכימיות טובות של תפקוד החלבון, אך יעילותן בבדיקות מבוססות תאים נמוכה. ישנן בדיקות מרובות לניטור פעילות ATG4B, כולל שיטות ביוכימיות ובדיקות מבוססות תאים4. פיתחנו בעבר בדיקה פשוטה, מבוססת לומינסנציה ובעלת תפוקה גבוהה לניטור פעילות ATG4B בתאים 8,17. בדיקה זו משתמשת בחלבון לוציפראז מנסיך גאוסיה (GLUC) שהוא יציב ופעיל בסביבה החוץ-תאית ויכול להשתחרר באופן אינדוקטיבי מתאים בתגובה לפעילות פרוטאוליטית ATG4B18,19.
במבנה כתב זה, dNGLUC מקושר לשלד האקטין של תאים. ניתן להכניס מקשר ספציפי לפרוטאז בין עוגן β אקטין לבין dNGLUC, מה שהופך את ההפרשה לתלויה במחשוף של המקשר. השתמשנו במסגרת קריאה פתוחה באורך מלא של LC3B בין β-actin ו-dNGLUC, כדי להיות מסוגלים לנטר מחשוף LC3B17,18,19. למרות שמנגנון ההפרשה של dNGLUC אינו מובן היטב, הוא ספציפי לניטור פעילות ATG4B, אינו תלוי באוטופגיה כללית כפי שהיא מתרחשת בתאי נוקאאוט ATG5, ומתווך על ידי מנגנונים לא קונבנציונליים שאינם דורשים פפטיד אות קלאסי 4,18,19. השתמשנו בהצלחה בכתב זה כדי לסנן מולקולות קטנות וספריות siRNA, וזיהינו רגולטורים חדשים של פעילות ATG4B, כגון חלבון Akt קינאזות8. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לשימוש בכתב לוציפראז זה בפורמט סינון חצי אוטומטי, בתפוקה גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר בדיקת גן דיווח מבוססת תאים לזיהוי מעכבי ATG4B. זיהוי פגיעות ראשוניות מבוסס על פעילות לוציפראז בטיפול בתאים המבטאים את מסגרת הקריאה הפתוחה באורך מלא של LC3B בין β-אקטין ל-dNGLUC. כמה יתרונות של בדיקה זו הם שזה רגיש, כמותי מאוד, ולא פולשני, כפי שהוא יכול לזהות dNGLUC מבלי לשקר את התאים. מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מימון ליבה של המועצה הבריטית למחקר רפואי ליחידת MRC-UCL University Grant Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (מענק 2018RIF_15), ותוכנית UCL Therapeutic Acceleration Support Scheme, הנתמכת על ידי מימון מ- MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. הפלסמיד המקודד ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) התקבל מד”ר רובין קטלר (המחלקה לרפואה אנושית, בית הספר לרפואה בברלין).
Materials
| 50 µL Disposable Tips – Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
- Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
- Fu, Y., et al. Targeting ATG4 in cancer therapy. Cancers. 11 (5), 649 (2019).
- Towers, C. G., Thorburn, A. Therapeutic targeting of autophagy. EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).
- Agrotis, A., Ketteler, R. On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns. Cells. 9 (1), 53 (2019).
- Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. Targeting autophagy in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).
- Kimmelman, A. C., White, E. Autophagy and tumor metabolism. Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).
- Tran, E., et al. Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).
- Pengo, N., et al. Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148 (2018).
- Kauffman, K. J., et al. Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases. Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).
- Tanida, I., Sou, Y. -. S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3. The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).
- Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells. Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).
- Ketteler, R., Tooze, S. A. ATG4: More than a protease. Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).
- Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy. Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).
- Fernández, &. #. 1. 9. 3. ;. F., López-Otín, C. The functional and pathologic relevance of autophagy proteases. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).
- Maruyama, T., Noda, N. N. Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition. The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).
- Ketteler, R., Seed, B. Quantitation of autophagy by luciferase release assay. Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).
- Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -. W., Seed, B. A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage. Genome Biology. 9 (4), 64 (2008).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15, 14 (2014).
- Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).
