Screening farmacologico cellulare per gli inibitori della peptidasi 4B cisteina correlata all'autofagia
Summary
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l’uso di un saggio reporter basato sulla luciferasi in un formato di screening semi-automatizzato ad alto rendimento.
Abstract
Prove crescenti hanno dimostrato che un elevato flusso autofagico è correlato alla progressione del tumore e alla resistenza alla terapia antitumorale. Il dosaggio delle singole proteine dell’autofagia è un prerequisito per le strategie terapeutiche mirate a questo percorso. È stato dimostrato che l’inibizione della proteasi autofagica ATG4B aumenta la sopravvivenza globale, suggerendo che ATG4B potrebbe essere un potenziale bersaglio farmacologico per la terapia del cancro. Il nostro laboratorio ha sviluppato un saggio selettivo basato sulla luciferasi per il monitoraggio dell’attività di ATG4B nelle cellule. Per questo saggio, il substrato di ATG4B, LC3B, è marcato all’estremità C con una luciferasi secretabile dal copepode marino Gaussia princeps (GLUC). Questo reporter è collegato al citoscheletro di actina, mantenendolo così nel citoplasma delle cellule quando non è disponibile. La scissione mediata da ATG4B provoca il rilascio di GLUC da parte di secrezioni non convenzionali, che possono quindi essere monitorate raccogliendo surnatanti da colture cellulari come correlato dell’attività cellulare di ATG4B. Questo articolo presenta l’adattamento di questo test basato sulla luciferasi allo screening automatizzato ad alto rendimento. Descriviamo il flusso di lavoro e l’ottimizzazione per un’analisi esemplare ad alto rendimento dell’attività cellulare ATG4B.
Introduction
L’autofagia è un processo metabolico conservato che consente alle cellule di mantenere l’omeostasi intracellulare e rispondere allo stress degradando il contenuto cellulare invecchiato, difettoso o non necessario attraverso i lisosomi 1,2,3. In alcune condizioni fisiopatologiche, questo processo agisce come una risposta cellulare cruciale alla privazione di nutrienti e ossigeno, con conseguente riciclaggio di nutrienti e lipidi, consentendo alle cellule di adattarsi alle loro esigenze metaboliche 2,3,4. L’autofagia è stata anche identificata come una risposta cellulare allo stress correlata a diverse malattie, come disturbi neurodegenerativi, infezioni da agenti patogeni e vari tipi di cancro. La funzione dell’autofagia nel cancro è complessa e dipende dal tipo, dallo stadio e dallo stato del tumore. Può sopprimere la tumorigenesi attraverso la degradazione autofagica delle cellule danneggiate, ma può anche promuovere la sopravvivenza dei tumori avanzati migliorando la sopravvivenza cellulare durante condizioni di stress, come l’ipossia, la privazione di nutrienti e il danno citotossico 2,4,5,6.
Diversi studi hanno dimostrato che l’inibizione dell’autofagia fornisce un beneficio come strategia antitumorale. Pertanto, l’inibizione di passaggi critici, come la formazione di un autofagosoma o la sua fusione con il lisosoma, potrebbe essere un metodo efficace per il controllo del cancro 2,4,5,6. Prove crescenti hanno dimostrato che ATG4B è coinvolto in alcune condizioni patologiche e ha guadagnato attenzione come potenziale bersaglio antitumorale 2,3,4. Ad esempio, è stato osservato che le cellule tumorali del colon-retto e le cellule di carcinoma mammario positive al recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano (HER2) avevano livelli di espressione di ATG4B significativamente più elevati rispetto alle cellule normali adiacenti 2,4. Nelle cellule di carcinoma prostatico, l’inibizione di ATG4B ha determinato una suscettibilità specifica della linea cellulare alla chemioterapia e alla radioterapia7. Recentemente, è emersa una forte evidenza che l’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è particolarmente vulnerabile all’inibizione di ATG4B. Ad esempio, in un modello murino geneticamente modificato, è stato dimostrato che la perdita intermittente della funzione di ATG4B riduce la crescita del tumore PDAC e aumenta la sopravvivenza 3,4. Nel complesso, ATG4B è altamente sovraespresso in alcuni tipi di cancro, è correlato alla progressione del tumore ed è legato alla resistenza alla terapia antitumorale 2,4,8.
Le proteasi della cisteina ATG4 nei mammiferi hanno quattro membri della famiglia, ATG4A-ATG4D. Queste proteine mostrano una certa selettività verso la famiglia di proteineLC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 e possono avere funzioni aggiuntive non legate alla loro attività proteasica 12,13. Inoltre, ATG4 ha la funzione di regolare un nuovo tipo di modificazione post-traduzionale, l’ATG8-ilazione delle proteine11,12. Mentre ATG4B e il suo substrato principale LC3B sono i più studiati, sta emergendo un quadro che suggerisce un ruolo complesso per ciascun membro della sottofamiglia nella regolazione dei processi autofagici e non autofagici. Ciò è ulteriormente corroborato da una complessa rete di modificazioni post-traduzionali che regolano l’attività di ATG4B attraverso la fosforilazione, l’acetilazione, la glicosilazione e la nitrosilazione 9,10,11,12,13.
Diversi inibitori noti di ATG4B sono stati pubblicati 2,4,14,15. Sebbene questi siano adatti come strumenti di ricerca, il loro profilo farmacodinamico, la loro selettività o la loro potenza hanno ancora precluso loro lo sviluppo come candidati preclinici 4,16. Nel complesso, c’è un urgente bisogno di identificare composti più potenti e selettivi. Spesso, i composti sono buoni inibitori biochimici della funzione proteica, ma la loro efficacia nei saggi basati su cellule è scarsa. Esistono diversi saggi per monitorare l’attività di ATG4B, inclusi metodi biochimici e saggi basati su cellule4. In precedenza abbiamo sviluppato un semplice saggio ad alto rendimento basato sulla luminescenza per il monitoraggio dell’attività di ATG4B nelle cellule 8,17. Questo test utilizza una proteina luciferasi di Gaussia princeps (GLUC) che è stabile e attiva nell’ambiente extracellulare e può essere rilasciata inducibilmente dalle cellule in risposta all’attività proteolitica di ATG4B18,19.
In questo costrutto reporter, dNGLUC è legato al citoscheletro di actina delle cellule. Un linker specifico per la proteasi può essere introdotto tra l’ancora β-actina e dNGLUC, trasformando la secrezione dipendente dalla scissione del linker. Abbiamo utilizzato il frame di lettura aperto a tutta lunghezza di LC3B tra β-actina e dNGLUC, per essere in grado di monitorare il clivaggioLC3B 17,18,19. Sebbene il meccanismo di secrezione di dNGLUC sia poco compreso, è specifico per il monitoraggio dell’attività di ATG4B, non dipende dall’autofagia complessiva come si verifica nelle cellule knockout ATG5 ed è mediato da meccanismi non convenzionali che non richiedono un peptide segnaleclassico 4,18,19. Abbiamo utilizzato con successo questo reporter per lo screening di piccole molecole e librerie di siRNA e abbiamo identificato nuovi regolatori dell’attività di ATG4B, come le chinasi proteiche Akt8. Questo documento descrive un protocollo dettagliato per l’uso di questo reporter luciferasi in un formato di screening semi-automatizzato ad alto rendimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un saggio basato su cellule reporter-gene per l’identificazione degli inibitori di ATG4B. L’identificazione dei riscontri primari si basa sull’attività della luciferasi durante il trattamento di cellule che esprimono il frame di lettura aperto a lunghezza intera di LC3B tra β-actina e dNGLUC. Alcuni vantaggi di questo test sono che è sensibile, altamente quantitativo e non invasivo, in quanto può rilevare dNGLUC senza lisare le cellule. Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal finanziamento di base del Medical Research Council del Regno Unito per la sovvenzione dell’unità universitaria MRC-UCL Ref MC_U12266B, dalla sovvenzione della piattaforma MRC Dementia UK MR/M02492X/1, dal cancro al pancreas nel Regno Unito (riferimento della sovvenzione 2018RIF_15) e dal programma di supporto all’accelerazione terapeutica dell’UCL, supportato dal finanziamento di MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. Il plasmide che codifica per l’ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) è stato ottenuto dal Dr. Robin Ketteler (Dipartimento di Medicina Umana, Facoltà di Medicina di Berlino).
Materials
| 50 µL Disposable Tips – Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
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