オートファジー関連4Bシステインペプチダーゼ阻害剤の細胞ベースの薬物スクリーニング
Summary
ここでは、ルシフェラーゼベースのレポーターアッセイを半自動のハイスループットスクリーニングフォーマットで使用するための詳細なプロトコルについて説明します。
Abstract
高いオートファジーフラックスが腫瘍の進行やがん治療抵抗性に関連していることを示す証拠が増えています。個々のオートファジータンパク質のアッセイは、この経路を標的とする治療戦略の前提条件です。オートファジープロテアーゼATG4Bの阻害は全生存期間を延長することが示されており、ATG4Bががん治療の創薬標的となる可能性が示唆されています。当研究室では、細胞内のATG4B活性をモニタリングするための選択的ルシフェラーゼベースのアッセイを開発しました。このアッセイでは、ATG4Bの基質であるLC3Bを、海産カイアシ類Gaussia princeps(GLUC)由来の分泌可能なルシフェラーゼでC末端にタグ付けします。このレポーターはアクチン細胞骨格と結合しているため、アクチンを切断しても細胞の細胞質に留まります。ATG4Bを介した切断により、従来とは異なる分泌によってGLUCが放出され、細胞のATG4B活性の相関関係として細胞培養から上清を採取することで監視できます。このホワイトペーパーでは、このルシフェラーゼベースのアッセイを自動ハイスループットスクリーニングに応用する方法を紹介します。細胞ATG4B活性の例示的なハイスループット解析のためのワークフローと最適化について説明します。
Introduction
オートファジーは、細胞が細胞内の恒常性を維持し、リソソームを介して老化した、欠陥のある、または不要な細胞内容物を分解することによってストレスに応答できるようにする保存された代謝プロセスです1,2,3。いくつかの病態生理学的条件下では、このプロセスは栄養素と酸素の欠乏に対する重要な細胞応答として機能し、栄養素と脂質がリサイクルされ、細胞が代謝ニーズに適応することを可能にします2,3,4。オートファジーは、神経変性疾患、病原体感染、各種がんなど、いくつかの疾患に関連する細胞ストレス応答としても確認されています。がんにおけるオートファジーの機能は複雑で、腫瘍の種類、病期、状態によって異なります。損傷した細胞のオートファジー分解によって腫瘍形成を抑制することができますが、低酸素、栄養欠乏、細胞傷害性損傷などのストレスの多い条件下での細胞生存を改善することにより、進行性腫瘍の生存を促進することもできます2,4,5,6。
いくつかの研究は、オートファジー阻害が抗がん戦略として有益であることを示しました。したがって、オートファゴソームの形成やリソソームとの融合などの重要なステップの阻害は、がん制御の効果的な方法である可能性があります2,4,5,6。ATG4Bが特定の病態に関与していることが次々と明らかになってきており、抗がん剤の標的として注目されています2,3,4。例えば、大腸がん細胞とヒト上皮成長因子受容体2(HER2)陽性乳がん細胞は、隣接する正常細胞よりもATG4B発現レベルが有意に高いことが観察されました2,4。前立腺癌細胞では、ATG4Bの阻害により、細胞株特異的に化学療法および放射線療法に対する感受性が生じた7。最近、膵管腺癌(PDAC)がATG4B阻害に対して特に脆弱であるという強力な証拠が浮上しています。例えば、遺伝子改変マウスモデルでは、ATG4B機能が断続的に失われると、PDAC腫瘍の増殖が抑制され、生存率が向上することが示されました3,4。全体として、ATG4Bは一部のがん種で高度に過剰発現しており、腫瘍の進行に関連し、がん治療抵抗性に関連しています2,4,8。
哺乳類のATG4システインプロテアーゼには、ATG4A-ATG4Dの4つのファミリーメンバーがあります。これらのタンパク質は、タンパク質のLC3 / GABARAP(ATG8)ファミリーに対していくつかの標的選択性を示し9,10,11、プロテアーゼ活性に関連しない追加の機能を有する可能性があります12,13。さらに、ATG4は、新しいタイプの翻訳後修飾であるタンパク質のATG8-イル化を調節する機能も備えています11,12。ATG4Bとその主要な基質であるLC3Bは最も広く研究されていますが、オートファジープロセスと非オートファジープロセスの制御における各サブファミリーメンバーの複雑な役割を示唆する図式が浮上しています。このことは、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、およびニトロシル化を介してATG4B活性を調節する翻訳後修飾の複雑なネットワークによってさらに裏付けられています9,10,11,12,13。
いくつかの既知のATG4B阻害剤が発表されています2,4,14,15。これらは研究ツールとして適していますが、その薬力学的プロファイル、選択性、または効力は、前臨床候補としての開発をまだ排除しています4,16。全体として、より強力で選択的な化合物を同定することが急務となっています。多くの場合、これらの化合物はタンパク質機能の優れた生化学的阻害剤ですが、細胞ベースのアッセイにおける有効性は低いです。ATG4B活性をモニターするためのアッセイには、生化学的方法や細胞ベースのアッセイなど、複数のアッセイがあります4。我々は以前、細胞内のATG4B活性をモニタリングするためのシンプルな発光ベースのハイスループットアッセイを開発した8,17。このアッセイは、細胞外環境で安定して活性であり、ATG4Bタンパク質分解活性に応答して細胞から誘導的に放出できるGaussia princeps(GLUC)由来のルシフェラーゼタンパク質を利用します18,19。
このレポーターコンストラクトでは、dNGLUCは細胞のアクチン細胞骨格に結合しています。プロテアーゼ特異的リンカーは、β-アクチンアンカーとdNGLUCの間に導入され、分泌物がリンカーの切断に依存するようになります。LC3Bの切断をモニターするために、β-アクチンとdNGLUCの間のLC3Bの全長オープンリーディングフレームを使用しました17,18,19。dNGLUCの分泌機構はよくわかっていませんが、ATG4B活性のモニタリングに特異的であり、ATG5ノックアウト細胞で発生するオートファジー全体に依存せず、古典的なシグナルペプチドを必要としない非従来型のメカニズムによって媒介されます4,18,19。このレポーターを使用して低分子やsiRNAライブラリーをスクリーニングすることに成功し、Aktプロテインキナーゼ8などのATG4B活性の新規制御因子を同定しました。この論文では、このルシフェラーゼレポーターを半自動のハイスループットスクリーニングフォーマットで使用するための詳細なプロトコルについて説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルはATG4Bの抑制剤の同一証明のためのセルベースのレポーター遺伝子の試金を記述する。一次ヒットの同定は、β-アクチンとdNGLUCの間のLC3Bの全長オープンリーディングフレームを発現する細胞の処理時のルシフェラーゼ活性に基づいています。このアッセイの利点は、細胞を溶解せずにdNGLUCを検出できるため、感度が高く、定量性が高く、非侵襲的であることです。この論文で?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B、MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1、Pancreatic Cancer UK(助成金参照2018RIF_15)、およびUCL Therapeutic Acceleration Supportスキームへの英国医学研究評議会のコア資金によって支援され、MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054からの資金提供によって支援されました。ActinLC3dNGLUC(pMOWS-ActinLC3dNGLUC)をコードするプラスミドは、Dr. Robin Ketteler(Department of Human Medicine, Medical School Berlin)から入手しました。
Materials
| 50 µL Disposable Tips – Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
- Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
- Fu, Y., et al. Targeting ATG4 in cancer therapy. Cancers. 11 (5), 649 (2019).
- Towers, C. G., Thorburn, A. Therapeutic targeting of autophagy. EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).
- Agrotis, A., Ketteler, R. On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns. Cells. 9 (1), 53 (2019).
- Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. Targeting autophagy in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).
- Kimmelman, A. C., White, E. Autophagy and tumor metabolism. Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).
- Tran, E., et al. Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).
- Pengo, N., et al. Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148 (2018).
- Kauffman, K. J., et al. Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases. Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).
- Tanida, I., Sou, Y. -. S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3. The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).
- Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells. Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).
- Ketteler, R., Tooze, S. A. ATG4: More than a protease. Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).
- Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy. Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).
- Fernández, &. #. 1. 9. 3. ;. F., López-Otín, C. The functional and pathologic relevance of autophagy proteases. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).
- Maruyama, T., Noda, N. N. Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition. The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).
- Ketteler, R., Seed, B. Quantitation of autophagy by luciferase release assay. Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).
- Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -. W., Seed, B. A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage. Genome Biology. 9 (4), 64 (2008).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15, 14 (2014).
- Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).
