Клеточный скрининг лекарственных препаратов на наличие ингибиторов аутофагии, связанной с 4B цистеин-пептидазой
Summary
Здесь мы опишем подробный протокол использования репортерного анализа на основе люциферазы в полуавтоматическом формате скрининга с высокой пропускной способностью.
Abstract
Появляется все больше доказательств того, что высокий аутофагический поток связан с прогрессированием опухоли и резистентностью к терапии рака. Анализ отдельных белков аутофагии является необходимым условием для терапевтических стратегий, нацеленных на этот путь. Было показано, что ингибирование протеазы аутофагии ATG4B увеличивает общую выживаемость, что позволяет предположить, что ATG4B может быть потенциальной мишенью для терапии рака. Наша лаборатория разработала селективный анализ на основе люциферазы для мониторинга активности ATG4B в клетках. Для этого анализа субстрат ATG4B, LC3B, помечается на С-конце секретируемой люциферазой морского веслоногого рачка Gaussia princeps (GLUC). Этот репортер связан с актиновым цитоскелетом, таким образом, удерживая его в цитоплазме клеток при расщеплении. ATG4B-опосредованное расщепление приводит к высвобождению GLUC путем нетрадиционной секреции, которую затем можно контролировать путем забора надосадочной жидкости из клеточной культуры в качестве коррелята клеточной активности ATG4B. В данной статье представлена адаптация этого анализа на основе люциферазы к автоматизированному высокопроизводительному скринингу. Описан рабочий процесс и оптимизация для примерного высокопроизводительного анализа клеточной активности ATG4B.
Introduction
Аутофагия — это консервативный метаболический процесс, который позволяет клеткам поддерживать внутриклеточный гомеостаз и реагировать на стресс путем разложения старого, дефектного или ненужного клеточного содержимого через лизосомы 1,2,3. При некоторых патофизиологических условиях этот процесс действует как важнейшая клеточная реакция на недостаток питательных веществ и кислорода, что приводит к рециркуляции питательных веществ и липидов, позволяя клеткам адаптироваться к своим метаболическим потребностям 2,3,4. Аутофагия также была идентифицирована как клеточная стрессовая реакция, связанная с несколькими заболеваниями, такими как нейродегенеративные расстройства, патогенные инфекции и различные виды рака. Функция аутофагии при раке сложна и зависит от типа, стадии и состояния опухоли. Он может подавлять опухолегенез путем аутофагической деградации поврежденных клеток, но также может способствовать выживанию прогрессирующих опухолей, улучшая выживаемость клеток во время стрессовых условий, таких как гипоксия, недостаток питательных веществ и цитотоксическое повреждение 2,4,5,6.
Несколько исследований показали, что ингибирование аутофагии обеспечивает преимущества в качестве противоопухолевой стратегии. Таким образом, ингибирование критических этапов, таких как образование аутофагосом или его слияние с лизосомой, может быть эффективным методом борьбы с раком 2,4,5,6. Растущее количество доказательств показало, что ATG4B участвует в определенных патологических состояниях, и он привлек внимание как потенциальная противораковая мишень 2,3,4. Например, было замечено, что клетки колоректального рака и рецептор эпидермального фактора роста человека 2 (HER2)-положительные клетки рака молочной железы имели значительно более высокие уровни экспрессии ATG4B, чем соседние нормальные клетки 2,4. В клетках рака предстательной железы ингибирование ATG4B приводило к специфической для клеточной линии восприимчивости к химиотерапии и лучевой терапии7. В последнее время появились убедительные доказательства того, что протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) особенно уязвима к ингибированию ATG4B. Например, на генетически модифицированной мышиной модели было показано, что периодическая потеря функции ATG4B снижает рост опухоли PDAC и увеличивает выживаемость 3,4. В целом, ATG4B имеет высокую гиперэкспрессию при некоторых типах рака, связан с прогрессированием опухоли и связан с резистентностью к терапии рака 2,4,8.
Цистеиновые протеазы ATG4 у млекопитающих имеют четыре члена семейства, ATG4A-ATG4D. Эти белки проявляют некоторую целевую селективность по отношению к семейству белковLC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 и могут иметь дополнительные функции, не связанные с их протеазной активностью 12,13. Кроме того, ATG4 функционирует в регуляции нового типа посттрансляционной модификации — ATG8-илирования белков11,12. В то время как ATG4B и его основной субстрат LC3B являются наиболее широко изученными, вырисовывается картина, которая предполагает сложную роль каждого члена подсемейства в регуляции аутофагических и неаутофагических процессов. Это также подтверждается сложной сетью посттрансляционных модификаций, которые регулируют активность ATG4B посредством фосфорилирования, ацетилирования, гликозилирования и нитрозилирования 9,10,11,12,13.
Несколько известных ингибиторов ATG4B были опубликованы 2,4,14,15. Несмотря на то, что они пригодны в качестве исследовательских инструментов, их фармакодинамический профиль, селективность или эффективность пока не позволяют разрабатывать их в качестве кандидатов на доклиническую стадию 4,16. В целом, существует острая необходимость в выявлении более мощных и селективных соединений. Часто эти соединения являются хорошими биохимическими ингибиторами функции белка, но их эффективность в клеточных анализах низкая. Существует несколько тестов для мониторинга активности ATG4B, включая биохимические методы и клеточные анализы4. Ранее мы разработали простой, основанный на люминесценции, высокопроизводительный анализ для мониторинга активности ATG4B в клетках 8,17. В этом анализе используется белок люциферазы из Gaussia princeps (GLUC), который стабилен и активен во внеклеточной среде и может быть индуцированно высвобожден из клеток в ответ на протеолитическую активность ATG4B18,19.
В этой репортерной конструкции dNGLUC связан с актиновым цитоскелетом клеток. Между β-актиновым якорем и dNGLUC может быть введен протеаза-специфический линкер, что делает секрецию зависимой от расщепления линкера. Мы использовали полноразмерную открытую рамку считывания LC3B между β-актином и dNGLUC, чтобы иметь возможность контролировать расщепление LC3B17,18,19. Хотя механизм секреции dNGLUC плохо изучен, он специфичен для мониторинга активности ATG4B, не зависит от общей аутофагии, как это происходит в нокаут-клетках ATG5, и опосредован нетрадиционными механизмами, не требующими классического сигнального пептида 4,18,19. Мы успешно использовали этот репортер для скрининга малых молекул и библиотек миРНК, а также идентифицировали новые регуляторы активности ATG4B, такие как протеинкиназыAkt 8. В этой статье описывается подробный протокол использования этого репортера люциферазы в полуавтоматическом формате скрининга с высокой пропускной способностью.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает клеточный анализ репортерных генов для идентификации ингибиторов ATG4B. Идентификация первичных попаданий основана на активности люциферазы при обработке клеток, экспрессирующих полноразмерную открытую рамку считывания LC3B между β-актином и dNGLUC. Некоторые преи?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана основным финансированием Совета по медицинским исследованиям Великобритании в рамках гранта MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, гранта MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (ссылка на грант 2018RIF_15) и схемы поддержки терапевтического ускорения UCL при финансовой поддержке MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. Плазмида, кодирующая ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC), была получена у доктора Робина Кеттелера (Robin Ketteler) (Факультет медицины человека, Берлинская медицинская школа).
Materials
| 50 µL Disposable Tips – Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
- Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
- Fu, Y., et al. Targeting ATG4 in cancer therapy. Cancers. 11 (5), 649 (2019).
- Towers, C. G., Thorburn, A. Therapeutic targeting of autophagy. EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).
- Agrotis, A., Ketteler, R. On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns. Cells. 9 (1), 53 (2019).
- Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. Targeting autophagy in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).
- Kimmelman, A. C., White, E. Autophagy and tumor metabolism. Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).
- Tran, E., et al. Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).
- Pengo, N., et al. Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148 (2018).
- Kauffman, K. J., et al. Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases. Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).
- Tanida, I., Sou, Y. -. S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3. The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).
- Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells. Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).
- Ketteler, R., Tooze, S. A. ATG4: More than a protease. Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).
- Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy. Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).
- Fernández, &. #. 1. 9. 3. ;. F., López-Otín, C. The functional and pathologic relevance of autophagy proteases. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).
- Maruyama, T., Noda, N. N. Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition. The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).
- Ketteler, R., Seed, B. Quantitation of autophagy by luciferase release assay. Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).
- Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -. W., Seed, B. A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage. Genome Biology. 9 (4), 64 (2008).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15, 14 (2014).
- Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).
