Otofaji ile İlişkili 4B Sistein Peptidaz İnhibitörleri için Hücre Bazlı İlaç Taraması
Summary
Burada, yarı otomatik, yüksek verimli bir tarama formatında lusiferaz bazlı bir raportör testinin kullanımı için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.
Abstract
Artan kanıtlar, yüksek otofajik akının tümör ilerlemesi ve kanser tedavisi direnci ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bireysel otofaji proteinlerinin tahlili, bu yolu hedefleyen terapötik stratejiler için bir ön koşuldur. Otofaji proteazı ATG4B’nin inhibisyonunun genel sağkalımı arttırdığı gösterilmiştir, bu da ATG4B’nin kanser tedavisi için potansiyel bir ilaç hedefi olabileceğini düşündürmektedir. Laboratuvarımız, hücrelerde ATG4B aktivitesini izlemek için seçici lusiferaz bazlı bir test geliştirmiştir. Bu tahlil için, ATG4B’nin substratı, LC3B, deniz kopepodu Gaussia princeps’ten (GLUC) salgılanabilir bir lusiferaz ile C-terminalinde etiketlenir. Bu raportör, aktin hücre iskeleti ile bağlantılıdır, böylece ayrılmadığında hücrelerin sitoplazmasında tutulur. ATG4B aracılı bölünme, geleneksel olmayan sekresyon yoluyla GLAC’ın salınmasına neden olur, bu daha sonra hücresel ATG4B aktivitesinin bir korelasyonu olarak hücre kültüründen süpernatanların toplanmasıyla izlenebilir. Bu makale, bu lusiferaz bazlı testin otomatik yüksek verimli taramaya uyarlanmasını sunmaktadır. Hücresel ATG4B aktivitesinin örnek niteliğindeki yüksek verimli analizi için iş akışını ve optimizasyonu açıklıyoruz.
Introduction
Otofaji, hücrelerin hücre içi homeostazı korumasına ve lizozomlar 1,2,3 yoluyla yaşlı, kusurlu veya gereksiz hücresel içerikleri parçalayarak strese yanıt vermesine izin veren korunmuş bir metabolik süreçtir. Bazı patofizyolojik koşullar altında, bu süreç, besin ve oksijen yoksunluğuna karşı çok önemli bir hücresel yanıt görevi görür ve geri dönüştürülmüş besinler ve lipitlerle sonuçlanırve hücrelerin metabolik ihtiyaçlarına uyum sağlamasına izin verir 2,3,4. Otofaji ayrıca nörodejeneratif bozukluklar, patojen enfeksiyonu ve çeşitli kanser türleri gibi çeşitli hastalıklarla ilişkili hücresel bir stres tepkisi olarak tanımlanmıştır. Kanserde otofajinin işlevi karmaşıktır ve tümörün tipine, evresine ve durumuna bağlıdır. Hasarlı hücrelerin otofajik bozunması yoluyla tümör oluşumunu baskılayabilir, ancak hipoksi, besin yoksunluğu ve sitotoksik hasargibi stresli koşullar sırasında hücre sağkalımını iyileştirerek ileri tümörlerin hayatta kalmasını da teşvik edebilir 2,4,5,6.
Birçok çalışma, otofaji inhibisyonunun bir antikanser stratejisi olarak fayda sağladığını göstermiştir. Bu nedenle, otofagozom oluşumu veya lizozomla füzyonu gibi kritik adımların inhibisyonu, kanser kontrolü için etkili bir yöntem olabilir 2,4,5,6. Artan kanıtlar, ATG4B’nin belirli patolojik durumlarda rol oynadığını göstermiştir ve potansiyel bir antikanser hedefiolarak dikkat çekmiştir 2,3,4. Örneğin, kolorektal kanser hücrelerinin ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) pozitif meme kanseri hücrelerinin, bitişik normal hücrelere göre önemli ölçüde daha yüksek ATG4B ekspresyon seviyelerinesahip olduğu gözlenmiştir 2,4. Prostat kanseri hücrelerinde, ATG4B’nin inhibisyonu, kemoterapi ve radyoterapiye hücre hattına özgü bir duyarlılıkla sonuçlandı7. Son zamanlarda, pankreatik duktal adenokarsinomun (PDAC) ATG4B inhibisyonuna karşı özellikle savunmasız olduğuna dair güçlü kanıtlar ortaya çıkmıştır. Örneğin, genetiği değiştirilmiş bir fare modelinde, ATG4B fonksiyonunun aralıklı kaybının PDAC tümör büyümesini azalttığı ve sağkalımı artırdığı gösterilmiştir 3,4. Genel olarak, ATG4B bazı kanser türlerinde yüksek oranda aşırı eksprese edilir, tümörün ilerlemesi ile ilgilidir ve kanser tedavisi direnciile bağlantılıdır 2,4,8.
Memelilerdeki ATG4 sistein proteazlarının ATG4A-ATG4D olmak üzere dört aile üyesi vardır. Bu proteinler, LC3/GABARAP (ATG8) protein ailesine 9,10,11 karşı bir miktar hedef seçicilik sergiler ve proteaz aktivitelerine12,13 bağlı olmayan ek işlevlere sahip olabilir. Ayrıca, ATG4, yeni bir translasyon sonrası modifikasyon türü olan proteinlerin ATG8-ilasyonunudüzenlemede işlev görür 11,12. ATG4B ve ana substratı LC3B en yaygın olarak çalışılanlar olsa da, otofajik ve otofajik olmayan süreçlerin düzenlenmesinde her bir alt aile üyesi için karmaşık bir rol öneren bir resim ortaya çıkmaktadır. Bu, fosforilasyon, asetilasyon, glikozilasyon ve nitrosilasyon yoluyla ATG4B aktivitesini düzenleyen karmaşık bir translasyon sonrası modifikasyon ağı ile daha da desteklenmektedir9,10,11,12,13.
Bilinen birkaç ATG4B inhibitörü yayınlanmıştır 2,4,14,15. Bunlar araştırma araçları olarak uygun olsa da, farmakodinamik profilleri, seçicilikleri veya potansiyelleri, klinik öncesi adaylar olarak gelişmelerini henüz engellemiştir 4,16. Genel olarak, daha güçlü ve seçici bileşiklerin tanımlanmasına acil bir ihtiyaç vardır. Genellikle, bileşikler protein fonksiyonunun iyi biyokimyasal inhibitörleridir, ancak hücre bazlı tahlillerdeki etkinlikleri zayıftır. Biyokimyasal yöntemler ve hücre bazlı testler dahil olmak üzere ATG4B aktivitesini izlemek için birden fazla test vardır4. Daha önce 8,17 hücrelerinde ATG4B aktivitesini izlemek için basit, lüminesans tabanlı, yüksek verimli bir test geliştirmiştik. Bu test, hücre dışı ortamda stabil ve aktif olan ve ATG4B proteolitik aktivitesine yanıt olarak hücrelerden indüklenebilir şekilde salınabilen Gaussia princeps’ten (GLUC) bir lusiferaz proteini kullanır18,19.
Bu raportör yapısında dNGLUC, hücrelerin aktin hücre iskeleti ile bağlantılıdır. β-aktin ankrajı ile dNGLUC arasına proteaza özgü bir bağlayıcı eklenebilir ve bu da sekresyonun bağlayıcının bölünmesine bağlı olmasını sağlar. LC3B bölünmesini izleyebilmek için LC3B’nin β-aktin ve dNGLUC arasında tam uzunlukta açık okuma çerçevesinikullandık 17,18,19. dNGLUC’un salgılama mekanizması tam olarak anlaşılamamış olsa da, ATG4B aktivitesini izlemek için spesifiktir, ATG5 nakavt hücrelerinde meydana geldiği gibi genel otofajiye bağlı değildir ve klasik bir sinyal peptidigerektirmeyen geleneksel olmayan mekanizmalar aracılık eder 4,18,19. Bu raporlayıcıyı küçük molekülleri ve siRNA kütüphanelerini taramak için başarıyla kullandık ve Akt protein kinazları8 gibi ATG4B aktivitesinin yeni düzenleyicilerini belirledik. Bu makale, bu lusiferaz raporlayıcının yarı otomatik, yüksek verimli bir tarama formatında kullanımı için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, ATG4B inhibitörlerinin tanımlanması için hücre bazlı bir raportör gen testini tanımlar. Birincil isabetlerin tanımlanması, β-aktin ve dNGLUC arasında LC3B’nin tam uzunlukta açık okuma çerçevesini eksprese eden hücrelerin işlenmesi üzerine lusiferaz aktivitesine dayanır. Bu testin bazı avantajları, hücreleri parçalamadan dNGLUC’u tespit edebildiği için hassas, oldukça kantitatif ve noninvaziv olmasıdır. Bu makale, kararlı bir hücre hattı ve birincil tarama oluşturmak için ayr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, MRC-UCL Üniversite Birimi Hibe Ref MC_U12266B, MRC Demans Platformu Hibesi İngiltere MR/M02492X/1, Pankreas Kanseri Birleşik Krallık (hibe referansı 2018RIF_15) ve UCL Terapötik Hızlandırma Destek programına yönelik Birleşik Krallık Tıbbi Araştırma Konseyi çekirdek finansmanı tarafından desteklenmiştir, MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054’ün finansmanıyla desteklenmiştir. ActinLC3dNGLUC’u (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) kodlayan plazmit, Dr. Robin Ketteler’den (Berlin Tıp Fakültesi İnsan Tıbbı Bölümü) elde edildi.
Materials
| 50 µL Disposable Tips – Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
- Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
- Fu, Y., et al. Targeting ATG4 in cancer therapy. Cancers. 11 (5), 649 (2019).
- Towers, C. G., Thorburn, A. Therapeutic targeting of autophagy. EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).
- Agrotis, A., Ketteler, R. On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns. Cells. 9 (1), 53 (2019).
- Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. Targeting autophagy in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).
- Kimmelman, A. C., White, E. Autophagy and tumor metabolism. Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).
- Tran, E., et al. Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).
- Pengo, N., et al. Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148 (2018).
- Kauffman, K. J., et al. Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases. Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).
- Tanida, I., Sou, Y. -. S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3. The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).
- Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells. Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).
- Ketteler, R., Tooze, S. A. ATG4: More than a protease. Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).
- Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy. Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).
- Fernández, &. #. 1. 9. 3. ;. F., López-Otín, C. The functional and pathologic relevance of autophagy proteases. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).
- Maruyama, T., Noda, N. N. Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition. The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).
- Ketteler, R., Seed, B. Quantitation of autophagy by luciferase release assay. Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).
- Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -. W., Seed, B. A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage. Genome Biology. 9 (4), 64 (2008).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15, 14 (2014).
- Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).
