Cellbaserad läkemedelsscreening för hämmare av autofagirelaterat 4B-cysteinpeptidas
Summary
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för användning av en luciferasbaserad reporteranalys i ett halvautomatiserat screeningformat med hög genomströmning.
Abstract
Växande bevis har visat att högt autofagiskt flöde är relaterat till tumörprogression och cancerterapiresistens. Analys av enskilda autofagiproteiner är en förutsättning för terapeutiska strategier som riktar sig mot denna signalväg. Hämning av autofagiproteaset ATG4B har visat sig öka den totala överlevnaden, vilket tyder på att ATG4B kan vara ett potentiellt läkemedelsmål för cancerbehandling. Vårt laboratorium har utvecklat en selektiv luciferasbaserad analys för övervakning av ATG4B-aktivitet i celler. För denna analys märks substratet för ATG4B, LC3B, vid C-terminalen med ett utsöndringsbart luciferas från den marina hoppkräftan Gaussia princeps (GLUC). Denna rapportör är kopplad till aktincytoskelettet och håller den på så sätt i cellernas cytoplasma när den är olöst. ATG4B-medierad klyvning resulterar i frisättning av GLUC genom icke-konventionell sekretion, som sedan kan övervakas genom att skörda supernatanter från cellodling som ett korrelat av cellulär ATG4B-aktivitet. Denna artikel presenterar anpassningen av denna luciferasbaserade analys till automatiserad screening med hög genomströmning. Vi beskriver arbetsflödet och optimeringen för exemplifierande analys av cellulär ATG4B-aktivitet med hög genomströmning.
Introduction
Autofagi är en konserverad metabolisk process som gör det möjligt för celler att behålla intracellulär homeostas och reagera på stress genom att bryta ner åldrat, defekt eller onödigt cellulärt innehåll via lysosomerna 1,2,3. Under vissa patofysiologiska förhållanden fungerar denna process som ett avgörande cellulärt svar på närings- och syrebrist, vilket resulterar i återvunna näringsämnen och lipider, vilket gör att cellerna kan anpassa sig till sina metaboliska behov 2,3,4. Autofagi har också identifierats som en cellulär stressreaktion relaterad till flera sjukdomar, såsom neurodegenerativa sjukdomar, patogeninfektion och olika typer av cancer. Autofagins funktion vid cancer är komplex och beroende av tumörens typ, stadium och status. Det kan undertrycka tumörbildning genom autofagisk nedbrytning av skadade celler, men kan också främja överlevnaden av avancerade tumörer genom att förbättra cellöverlevnaden under stressiga förhållanden, såsom hypoxi, näringsbrist och cytotoxisk skada 2,4,5,6.
Flera studier har visat att autofagihämning ger en fördel som en anticancerstrategi. Således kan hämning av kritiska steg, såsom autofagosombildning eller dess fusion med lysosomen, vara en effektiv metod för cancerkontroll 2,4,5,6. Växande bevis har visat att ATG4B är involverat i vissa patologiska tillstånd, och det har fått uppmärksamhet som ett potentiellt mål mot cancer 2,3,4. Till exempel observerades att kolorektala cancerceller och humana epidermala tillväxtfaktorreceptor 2 (HER2)-positiva bröstcancerceller hade signifikant högre ATG4B-uttrycksnivåer än intilliggande normala celler 2,4. I prostatacancerceller resulterade hämning av ATG4B i en cellinjespecifik känslighet för kemoterapi och strålbehandling7. På senare tid har det framkommit starka bevis för att bukspottkörtelcancer (PDAC) är särskilt sårbart för ATG4B-hämning. Till exempel, i en genetiskt modifierad musmodell, visades det att intermittent förlust av ATG4B-funktion minskar PDAC-tumörtillväxt och ökar överlevnaden 3,4. Sammantaget är ATG4B kraftigt överuttryckt i vissa cancertyper, är relaterat till tumörprogression och är kopplat till cancerterapiresistens 2,4,8.
ATG4-cysteinproteaserna hos däggdjur har fyra familjemedlemmar, ATG4A-ATG4D. Dessa proteiner uppvisar en viss målselektivitet mot LC3/GABARAP (ATG8)-familjen av proteiner 9,10,11 och kan ha ytterligare funktioner som inte är kopplade till deras proteasaktivitet12,13. Dessutom fungerar ATG4 för att reglera en ny typ av posttranslationell modifiering, ATG8-ylering av proteiner11,12. Medan ATG4B och dess huvudsubstrat LC3B är de mest studerade, framträder en bild som tyder på en komplex roll för varje underfamiljemedlem i regleringen av autofagiska och icke-autofagiska processer. Detta bekräftas ytterligare av ett komplext nätverk av posttranslationella modifieringar som reglerar ATG4B-aktivitet via fosforylering, acetylering, glykosylering och nitrosylering 9,10,11,12,13.
Flera kända ATG4B-hämmare har publicerats 2,4,14,15. Även om dessa är lämpliga som forskningsverktyg, har deras farmakodynamiska profil, selektivitet eller styrka ännu hindrat dem från att utvecklas som prekliniska kandidater 4,16. Sammantaget finns det ett akut behov av att identifiera mer potenta och selektiva föreningar. Ofta är föreningarna bra biokemiska hämmare av proteinfunktion, men deras effektivitet i cellbaserade analyser är dålig. Det finns flera analyser för att övervaka ATG4B-aktivitet, inklusive biokemiska metoder och cellbaserade analyser4. Vi har tidigare utvecklat en enkel, luminiscensbaserad high-throughput-analys för övervakning av ATG4B-aktivitet i cell 8,17. Denna analys använder ett luciferasprotein från Gaussia princeps (GLUC) som är stabilt och aktivt i den extracellulära miljön och kan induceras från celler som svar på ATG4B proteolytisk aktivitet18,19.
I denna reporterkonstruktion är dNGLUC kopplat till cellernas aktincytoskelett. En proteasspecifik länkare kan föras in mellan β-aktinankaret och dNGLUC, vilket gör sekretet beroende av klyvningen av länkaren. Vi använde LC3B:s öppna läsram i full längd mellan β-aktin och dNGLUC för att kunna övervaka LC3B-klyvning17,18,19. Även om utsöndringsmekanismen för dNGLUC är dåligt förstådd, är den specifik för övervakning av ATG4B-aktivitet, beror inte på övergripande autofagi som den förekommer i ATG5 knockout-celler och medieras av icke-konventionella mekanismer som inte kräver en klassisk signalpeptid 4,18,19. Vi har framgångsrikt använt denna reporter för att screena små molekyler och siRNA-bibliotek, och har identifierat nya regulatorer av ATG4B-aktivitet, såsom Akt-proteinkinaserna8. Denna uppsats beskriver ett detaljerat protokoll för användning av denna luciferasrapportör i ett halvautomatiserat screeningformat med hög genomströmning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver en cellbaserad reporter-genanalys för identifiering av ATG4B-hämmare. Identifieringen av primära träffar baseras på luciferasaktivitet vid behandling av celler som uttrycker LC3B:s öppna läsram i full längd mellan β-aktin och dNGLUC. Några fördelar med denna analys är att den är känslig, mycket kvantitativ och icke-invasiv, eftersom den kan detektera dNGLUC utan att lysera cellerna. Denna artikel presenterar ett detaljerat protokoll för att generera en stabil cellinje och en prim?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av UK Medical Research Councils kärnfinansiering till MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (anslagsreferens 2018RIF_15) och UCL Therapeutic Acceleration Support-programmet, med stöd av finansiering från MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. Plasmiden som kodar för ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) erhölls från Dr. Robin Ketteler (Institutionen för humanmedicin, Medical School Berlin).
Materials
| 50 µL Disposable Tips – Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
- Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
- Fu, Y., et al. Targeting ATG4 in cancer therapy. Cancers. 11 (5), 649 (2019).
- Towers, C. G., Thorburn, A. Therapeutic targeting of autophagy. EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).
- Agrotis, A., Ketteler, R. On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns. Cells. 9 (1), 53 (2019).
- Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. Targeting autophagy in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).
- Kimmelman, A. C., White, E. Autophagy and tumor metabolism. Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).
- Tran, E., et al. Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).
- Pengo, N., et al. Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148 (2018).
- Kauffman, K. J., et al. Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases. Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).
- Tanida, I., Sou, Y. -. S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3. The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).
- Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells. Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).
- Ketteler, R., Tooze, S. A. ATG4: More than a protease. Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).
- Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy. Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).
- Fernández, &. #. 1. 9. 3. ;. F., López-Otín, C. The functional and pathologic relevance of autophagy proteases. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).
- Maruyama, T., Noda, N. N. Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition. The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).
- Ketteler, R., Seed, B. Quantitation of autophagy by luciferase release assay. Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).
- Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -. W., Seed, B. A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage. Genome Biology. 9 (4), 64 (2008).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15, 14 (2014).
- Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).
