Ex Vivo (Canlı Canlı) 3D Baskılı Biyoreaktörde Büyük Kan Damarlarının Perfüzyon Kültürü
Summary
Bu protokol, perfüzyonda kan damarlarının ex vivo kültürü için yeni geliştirilen, 3D baskılı bir biyoreaktörün kurulumunu ve çalıştırılmasını sunar. Sistem, diğer kullanıcılar tarafından kolayca benimsenebilecek, pratik, uygun fiyatlı ve temel biyoloji ve farmakolojik çalışmalar gibi farklı deneysel uygulamalara uyarlanabilir şekilde tasarlanmıştır.
Abstract
Vasküler hastalıklar, tüm dünyada mortalite ve morbiditenin birincil nedeni olmaya devam eden çoğu kardiyovasküler hastalığın (KVH) temelini oluşturur. Vasküler hastalıkları önlemek ve tedavi etmek için etkili cerrahi ve farmakolojik müdahalelere acilen ihtiyaç vardır. Kısmen, translasyonel modellerin eksikliği, vasküler hastalıkta yer alan hücresel ve moleküler süreçlerin anlaşılmasını sınırlamaktadır. Ex vivo perfüzyon kültürü biyoreaktörleri, in vitro kültürün kolaylığını ve canlı dokunun karmaşıklığını birleştirerek, kontrollü dinamik bir ortamda büyük hayvan damarlarının (insanlar dahil) incelenmesi için ideal bir platform sağlar. Bununla birlikte, çoğu biyoreaktör özel olarak üretilir ve bu nedenle sonuçların tekrarlanabilirliğini sınırlayarak benimsenmesi zordur. Bu makale, herhangi bir biyolojik laboratuvarda kolayca üretilebilen ve uygulanabilen 3D baskılı bir sistem sunar ve kurulumu için ayrıntılı bir protokol sağlayarak kullanıcıların çalışmasını sağlar. Bu yenilikçi ve tekrarlanabilir ex vivo perfüzyon kültür sistemi, fizyolojik koşullarda 7 güne kadar kan damarlarının kültürlenmesini sağlar. Standartlaştırılmış bir perfüzyon biyoreaktörünün benimsenmesinin, büyük hayvan kan damarlarındaki fizyolojik ve patolojik süreçlerin daha iyi anlaşılmasını destekleyeceğini ve yeni terapötiklerin keşfini hızlandıracağını umuyoruz.
Introduction
Vasküler duvar, hem dış uyaranlara (yani basınç değişikliği, vazokonstriktörler) hem de kan pıhtılaşmasını ve enflamatuar hücre infiltrasyonunu önleyen tutarlı bir aktive olmayan yüzey sağlayan reaktif sabit bir durumda bulunur1. Yaşlanmaya ve yaşam tarzına bağlı uyaranlara yanıt olarak ve doğrudan hasar üzerine vasküler duvar, iskemik inme ve miyokard enfarktüsü gibi yaygın kardiyovasküler hastalıklara (KVH’ler) katkıda bulunduğu bilinen restenoz ve ateroskleroz gibi yeniden şekillenme süreçlerini aktive eder2. Vasküler hastalığın ilerlemiş bulgularının üstesinden gelmek için perkütan revaskülarizasyon ve stentleme gibi girişimsel yaklaşımlar mevcut olsa da, bunların daha fazla vasküler hasara neden olduğu ve sıklıkla nükslere yol açtığı bilinmektedir. Ek olarak, yalnızca sınırlı önleyici ve erken aşama çözümler mevcuttur. Vasküler duvar homeostazını sürdüren ve işlev bozukluğunu yönlendiren mekanizmaları anlamak, yeni tedaviler geliştirmenin merkezinde yer alır3.
Moleküler biyoloji ve doku mühendisliğindeki sürekli gelişme ve ilerlemelere rağmen, hayvan çalışmaları vasküler biyoloji çalışmalarının çok önemli bir bileşeni olmaya devam etmektedir. İn vivo hayvan çalışmaları, vasküler homeostaz ve patoloji mekanizmaları hakkında muazzam bir fikir vermiştir; Bununla birlikte, bu prosedürler maliyetlidir, nispeten düşük verime sahiptir ve önemli etik sorunlar ortaya çıkarır. Ek olarak, küçük hayvanlar insan vasküler fizyolojisini zayıf bir şekilde temsil eder ve daha büyük hayvan deneyleri çok daha pahalıdır ve daha fazla etik husus yaratır 4,5. Hızla yaşlanan bir nüfus için farmasötik ve tıbbi çözümlere yönelik artan taleple birlikte, hayvan kullanımının olumsuz yönleri büyütülmekte ve sonuçların tekrarlanabilirliğini, güvenilirliğini ve hasta bakımına aktarılabilirliğini etkilemektedir6.
İn vitro sistemler, temel mekanizmaları incelemek için basitleştirilmiş bir platform sunar, ancak tüm dokunun karmaşıklığını, hücreler ve hücre dışı matris arasındaki etkileşimleri ve vasküler hastalıkların gelişiminde kritik belirleyiciler olan mekanik kuvvetleri özetlemekte başarısız olur7.
Yapay olarak kontrol edilen ortamlarda tutulan tüm dokular üzerinde gerçekleştirilen ex vivo çalışmalar, nispeten yüksek verimli araştırmalara olanak tanırken in vivo karmaşıklığı taklit eder8. Kültür koşullarını ve çevreyi yakından kontrol etme yeteneği göz önüne alındığında, ex vivo modeller çok çeşitli karmaşık çalışmalara izin verir ve vasküler biyolojide hayvan prosedürlerinin kullanımını azaltmak için uygun bir alternatif sunar. Statik vasküler halka kültürleri ilginç bilgiler sundu, ancak önemli hemodinamik unsuru dahil etmede başarısızoldu 9. Gerçekten de, vasküler sistemin ex vivo çalışması, kan damarı duvarındaki hücrelere uygulanan birçok dinamik kuvvetle ilgili belirli zorluklar ortaya koymaktadır. Luminal akış, türbülans, kayma gerilmesi, basınç ve duvar deformasyonu gibi uyaranlar doku patofizyolojisini önemli ölçüde etkiler10,11,12.
Perfüzyon biyoreaktörleri, yaralanma veya hemodinamik değişikliklere yanıt olarak vasküler homeostazı ve yeniden şekillenmeyi incelemek için gereklidir13. Ayrıca, perfüzyon kültürü, doku mühendisliği kan damarlarının (TEBV’ler) olgunlaşmasını ve dayanıklılığını artırmak için kullanılabilir ve vasküler greftler için uygun alternatifler sağlar14.
Ticari olarak temin edilebilen perfüzyon biyoreaktörleri esneklik ve uyarlanabilirlik açısından sınırlıdır ve maliyetlidir. Mevcut şirket içinde geliştirilen biyoreaktörlerin çoğunun, sınırlı açıklamalar ve özel olarak yapılmışbileşenlerin 7,8,9,10,11,12 bulunmaması nedeniyle diğer laboratuvarlarda çoğaltılması zordur. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, yakın zamanda üretimi ekonomik olan, bir dizi dokuyu barındıran ve farklı araştırma taleplerine uyum sağlamak için nispeten basit modifikasyonlara olanak tanıyan yeni bir biyoreaktör (EasyFlow) geliştirdik13. Ek parça 3D baskılıdır ve standart 50 mL santrifüj tüpünün kapağına oturur. Modüler tasarımı ve 3D baskı üretimi, farklı laboratuvarlarda erişilebilir ve tekrarlanabilir olmasının yanı sıra farklı bilimsel ihtiyaçlara uyum sağlamak için kolayca değiştirilebilir olmasını sağlar. Bu protokol, biyoreaktör sisteminin bir arteriyel perfüzyon ortamında montajını ve temel çalışmasını açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo vasküler perfüzyon sistemleri, kontrollü koşullar altında doğal dokularındaki vasküler hücrelerin işlev ve davranışlarını incelemek için benzersiz bir platform oluşturur ve bu da yaralanma sonrası vasküler yeniden şekillenme gibi karmaşık süreçlerin diseksiyonunu sağlar22. Bununla birlikte, rapor edilen biyoreaktörlerin çoğu, ısmarlama bileşenlere dayalı şirket içi sistemlerdir ve genellikle başkaları tarafından kopyalanması zordur<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, histoloji hizmetleri için Surrey Üniversitesi Veterinerlik Fakültesi’ndeki Veteriner Patoloji Merkezi’ne teşekkür etmek istiyor. Ayrıca Pirbright Enstitüsü’nden (Pirbright, İngiltere) Dr. L. Dixon, A. Reis ve M. Henstock’a hayvan dokularının teminindeki destekleri için ve Surrey Üniversitesi Biyokimyasal Bilimler Bölümü’ne, özellikle de teknik ekibe sürekli destekleri için teşekkür ederiz. RSM, Doktora Koleji öğrenci ödülü (Surrey Üniversitesi) tarafından desteklenmiştir, DM ve PC, Araştırmada Hayvanların Değiştirilmesi, İyileştirilmesi ve Azaltılması Ulusal Merkezi tarafından desteklenmiştir (hibe numaraları: NC / R001006 / 1 ve NC / T001216 / 1).
Materials
| EasyFlow | – | – | 3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs |
| PA12 – 3D printing | Protolabs | – | – |
| Peristaltic pump | Heidolph | PD5201 | |
| Culture media components: | |||
| Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water | Sigma-Aldrich | A2942-20ML | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8802-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Immunostaining materials: | |||
| Cryostat | LEICA | CM3050 S | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Invitrogen eBioscience Fluoromount G | Thermo Fisher Scientific | 50-187-88 | |
| MX35 Premier + Microtome Blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| Optimal Cooling Tempearure Compound – OCT | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Rabbit α-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Sudan Black B | Santa Cruz Biotechnology | SC-203760 | |
| X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box | Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody | R&D Systems | IC1420R | |
| Material for laser cutting of components: | |||
| Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of washers) | RS Components | 258-6590 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Optional pressure monitors: | |||
| Pressure sensor | Parker Hannifin | 080-699PSX-3P-5 | |
| SciPres Pressure Monitor | Parker Hannifin | 206-200-M | |
| Pre-sterilized single use plasticware: | |||
| 0.2 um filter | Sarstedt | 70.1114.210 | |
| 20 mL Sterile syringe | IMS Euro | 40004 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | Sarstedt – 62.547.254 | |
| Small components: | |||
| Cable ties | – | – | |
| Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb | Cole-Parmer | WZ-30800-10 | Barb Adaptor |
| Masterflex Polycarbonate Luer Fittings | Cole-Parmer | AU-45504-84 | |
| Nylon Miniature Check Valve | Cole-Parmer | 98553-00 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Stainless Steel M2 Hex Nuts | RS Components | 527-218 | |
| Stainless Steel M2 x 6 mm Screws | RS Components | 418-7426 | |
| Stainless Steel M5 Hex Nuts | RS Components | 189-585 | |
| Surgical vessel loop | Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies | 10-1003 | |
| Three-way valves | IMS Euro | 91000 | |
| Surgical Equipment | |||
| Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07 | International Medical Supplies | SKU: BD-07 | |
| Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm | International Medical Supplies | SKU: BD-361 | |
| Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm | International Medical Supplies | SKU: FD-12 | |
| Troge Surgical Scalpels – Size 23 – Box of 100 | International Medical Supplies | 63114 | |
| Tubing: | |||
| Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm) | Eppendorf | M0740-2396 | System tubing |
| Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing | ISMATEC | 95714-48 | Soft wall tubing (for clamp) |
| RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone | RS Components | 667-8432 | Resistance tubing (small inner diameter) |
| Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm) | Heidolph | 525-30027-00-0 | One way valve tube |
| Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene | RS Components | 125-4042 | Pump Tubing |
References
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: Endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Gugliandolo, E., et al. Palmitoylethanolamide and Polydatin combination reduces inflammation and oxidative stress in vascular injury. Pharmacological Research. 123, 83-92 (2017).
- Anselmino, M., et al. Catheter ablation of atrial fibrillation in patients with left ventricular systolic dysfunction: A systematic review and meta-analysis. Circulation, Arrhythmia, and Electrophysiology. 7 (6), 1011-1018 (2014).
- Viola, M., et al. Subcutaneous delivery of monoclonal antibodies: How do we get there. Journal of Controlled Release. 286, 301-314 (2018).
- Kim, D. D. In vitro cellular models for nasal drug absorption studies. Drug Absorption Studies: In Situ, In Vitro and In Silico Models. , 216-234 (2008).
- Lewis, D. I. Animal experimentation: Implementation and application of the 3Rs. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (6), 675-679 (2019).
- Rouwkema, J., et al. In vitro platforms for tissue engineering: Implications for basic research and clinical translation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e164-167 (2011).
- Xu, Y., Shrestha, N., Préat, V., Beloqui, A. An overview of in vitro, ex vivo and in vivo models for studying the transport of drugs across intestinal barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113795 (2021).
- Vaghela, R., et al. Vessel grafts for tissue engineering revisited-Vessel segments show location-specific vascularization patterns in ex vivo ring assay. Microcirculation. 29 (2), e12742 (2022).
- Håkansson, J., et al. Individualized tissue-engineered veins as vascular grafts: A proof of concept study in pig. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 15 (10), 818-830 (2021).
- Saucy, F., et al. Ex vivo pulsatile perfusion of human saphenous veins induces intimal hyperplasia and increased levels of the plasminogen activator inhibitor 1. European Surgical Research. 45 (1), 50-59 (2010).
- Tosun, Z., McFetridge, P. S. Variation in cardiac pulse frequencies modulates vSMC phenotype switching during vascular remodeling. Cardiovascular Engineering and Technology. 6 (1), 59-70 (2015).
- Matos, R. S., Maselli, D., McVey, J. H., Heiss, C., Campagnolo, P. 3D printed bioreactor enabling the pulsatile culture of native and angioplastied large arteries. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 864580 (2022).
- Neff, L. P., et al. Vascular smooth muscle enhances functionality of tissue-engineered blood vessels in vivo. Journal of Vascular Surgery. 53 (2), 426-434 (2011).
- Boparai, K. S., Singh, R. Advances in Fused Deposition Modeling. In: Module. Refrence in Materials Science and Materials Engineering. , (2017).
- McKeen, L. W., McKeen, L. W. Chapter 6 – Polyamides (Nylons). The Effect of Creep and Other Time Related Factors on Plastics and Elastomers (Second Edition). , 197-262 (2012).
- Moradi, M., Mehrabi, O., Azdast, T., Benyounis, K. Y. Enhancement of low power CO2 laser cutting process for injection molded polycarbonate). Optics & Laser Technology. 96, 208-218 (2017).
- Ghasem, N. . Computer Methods in Chemical Engineering. , (2021).
- Lying, F., Gazi, F., Gardner, E. Preparation of tissues and cells for infrared and raman spectroscopy and imaging. Biomedical Applications of Synchrotron Infrared Microspectroscopy.RSC Analytical Spectroscopy Monographs. (11), 147-185 (2011).
- Sassi, L., et al. A perfusion bioreactor for longitudinal monitoring of bioengineered liver constructs. Nanomaterials. 11 (2), 275 (2021).
- Haykal, S., et al. Double-chamber rotating bioreactor for dynamic perfusion cell seeding of large-segment tracheal allografts: Comparison to conventional static methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (8), 681-692 (2014).
- Kural, M. H., Dai, G., Niklason, L. E., Gui, L. An ex vivo vessel injury model to study remodeling. Cell Transplant. 27 (9), 1375-1389 (2018).
- Wong, M. M., Hong, X., Karamariti, E., Hu, Y., Xu, Q. Generation and grafting of tissue-engineered vessels in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (97), 52565 (2015).
- Alvino, V. V., et al. In vitro and in vivo preclinical testing of pericyte-engineered grafts for the correction of congenital heart defects. Journal of the American Heart Association. 9 (4), e014214 (2020).
- Nerurkar, N. L., Sen, S., Baker, B. M., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Dynamic culture enhances stem cell infiltration and modulates extracellular matrix production on aligned electrospun nanofibrous scaffolds. Acta Biomaterialia. 7 (2), 485-491 (2011).
- Engebretson, B., Mussett, Z. R., Sikavitsas, V. I. The effects of varying frequency and duration of mechanical stimulation on a tissue-engineered tendon construct. Connective Tissue Research. 59 (2), 167-177 (2018).
- Saunders, S. K., et al. Evaluation of perfusion-driven cell seeding of small diameter engineered tissue vascular grafts with a custom-designed seed-and-culture bioreactor. PLoS One. 17 (6), e0269499 (2022).
- Stephenson, M., Grayson, W. Recent advances in bioreactors for cell-based therapies. F1000Research. 7, (2018).
