إنتاج الخلايا على نطاق واسع على أساس الناقلات الدقيقة المسامية القابلة للذوبان من الدرجة GMP
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لتحقيق التصنيع على نطاق واسع للخلايا الملتصقة من خلال نظام مغلق تماما يعتمد على ناقلات دقيقة قابلة للذوبان من فئة GMP. تم التحقق من صحة زراعة الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية والخلايا HEK293T وخلايا Vero وتلبية متطلبات الكمية ومعايير الجودة لصناعة العلاج بالخلايا والجينات.
Abstract
واجه الباحثون في صناعة العلاج بالخلايا والجينات (CGT) منذ فترة طويلة تحديا هائلا في التوسع الفعال والواسع النطاق للخلايا. لمعالجة أوجه القصور الأساسية في نظام الاستزراع المستوي ثنائي الأبعاد (2D) ، قمنا بتطوير منصة إنتاج خلايا آلية مغلقة النطاق الصناعي (ACISCP) تعتمد على ناقل دقيق من الدرجة GMP وقابل للذوبان ومسامي لثقافة 3D للخلايا الملتصقة ، بما في ذلك الخلايا الجذعية / اللحمة المتوسطة البشرية (hMSCs) وخلايا HEK293T وخلايا Vero. لتحقيق توسع واسع النطاق ، تم إجراء توسع على مرحلتين مع مفاعلات حيوية ذات خزان تحريك 5 لتر و 15 لتر لإنتاج 1.1 × 1010 hMSCs مع توسع إجمالي 128 ضعفا في غضون 9 أيام. تم حصاد الخلايا عن طريق إذابة الناقلات الدقيقة تماما ، وتركيزها وغسلها وصياغتها باستخدام نظام معالجة الخلايا القائم على الطرد المركزي المستمر التدفق ، ثم تم اقتباسها بنظام ملء الخلايا. بالمقارنة مع الثقافة المستوية 2D ، لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية في جودة hMSCs التي يتم حصادها من ثقافة 3D. لقد قمنا أيضا بتطبيق هذه الناقلات الدقيقة المسامية القابلة للذوبان على أنواع الخلايا الشائعة الأخرى في قطاع CGT. على وجه التحديد ، تمت زراعة خلايا HEK293T وخلايا Vero لذروة كثافة الخلايا 1.68 × 107 خلايا / مل و 1.08 × 107 خلايا / مل ، على التوالي. توفر هذه الدراسة بروتوكولا لاستخدام منصة هندسة العمليات الحيوية التي تسخر خصائص الناقلات الدقيقة القابلة للذوبان من فئة GMP والمعدات المغلقة المتقدمة لتحقيق التصنيع على نطاق صناعي للخلايا الملتصقة.
Introduction
شهدت صناعة CGT توسعا هائلا على مدار العقدين الماضيين. من المتوقع أن يؤدي تطور أدوية الجيل التالي إلى علاج وعلاج العديد من الأمراض المقاومةللحرارة 1. منذ أول موافقة من إدارة الغذاء والدواء (FDA) على منتج CGT ، Kymriah ، في عام 2017 ، استمر البحث والتطوير المتعلق ب CGT في العالم في النمو بمعدل سريع ، حيث شهدت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية زيادة تطبيقات الأدوية الجديدة التجريبية النشطة ل CGT إلى 500 في 20182. كان من المتوقع أن يكون عدد الموافقات على منتجات CGT على الأرجح 54-74 في الولايات المتحدة بحلول عام 20302.
في حين أن النمو السريع في أبحاث CGT والابتكار مثير ، لا تزال هناك فجوة تكنولوجية كبيرة بين الأبحاث المعملية والتصنيع على نطاق صناعي يمكن أن تقدم هذه الأدوية الواعدة للوصول إلى أكبر عدد ممكن من المرضى حسب الحاجة بتكاليف معقولة. تم إنشاء العمليات الحالية المعتمدة لهذه التجارب السريرية في المختبرات للتجارب الصغيرة ، وهناك حاجة إلى بذل جهود كبيرة لتحسين وابتكار تصنيع CGT3. هناك العديد من أنواع منتجات CGT ، يعتمد معظمها على الخلايا الحية ، والتي يمكن أن تكون خيفية أو ذاتية أو هندسية أو طبيعية. هذه الأدوية الحية أكثر تعقيدا بكثير من الكيانات الجزيئية الصغيرة أو البيولوجية ، مما يجعل التصنيع على نطاق واسع تحديا كبيرا4،5،6. في هذا العمل ، نوضح بروتوكول إنتاج الخلايا على نطاق واسع لثلاث خلايا تعتمد على المرسى والتي يتم تطبيقها على نطاق واسع في CGTs. وتشمل هذه الخلايا الجذعية / اللحمة المتوسطة البشرية (hMSCs) ، والتي تم استخدامها للعلاج القائم على الخلايا ، والخلايا HEK293T وخلايا Vero ، وكلاهما يستخدم لإنتاج فيروسات للهندسة الوراثية لمنتج الخلية العلاجية النهائي. عادة ما يتم استزراع الخلايا المعتمدة على المرساة على أنظمة مستوية ، والتي تتطلب معالجة يدوية. ومع ذلك ، تتطلب طرق الزراعة اليدوية قدرا كبيرا من العمالة وتكون عرضة للتلوث ، مما قد يضر بجودة المنتج النهائي. علاوة على ذلك ، لا يوجد تحكم في العملية على الخط ، مما يؤدي إلى تباين كبير في الجودة بين الدفعات7. إذا أخذنا العلاج بالخلايا الجذعية كمثال ، مع وجود خط أنابيب واعد يضم أكثر من 200 مرشح للعلاج بالخلايا الجذعية ، تشير التقديرات إلى أن هناك حاجة إلى 300 تريليون hMSCs سنويا لتلبية متطلبات التطبيقات السريرية8. وبالتالي ، أصبح التصنيع على نطاق واسع للخلايا العلاجية شرطا أساسيا لإجراء هذه التدخلات العلاجية مع هذا الطلب العالي على الخلايا9.
وللحيلولة دون حدوث انتكاسات للنظم المستوية، بذلت جهود في تطوير عمليات تصنيع واسعة النطاق في المفاعلات الحيوية ذات الصهاريج المقلوبة ذات الناقلات الدقيقة التقليدية غير القابلة للذوبان10،11،12،13، ولكنها تعاني من إجراءات تحضير معقدة وكفاءة حصاد خلايامنخفضة 14. في الآونة الأخيرة ، ابتكرنا حاملا دقيقا قابلا للذوبان لتوسيع الخلايا الجذعية ، بهدف التحايل على تحديات حصاد الخلايا من الناقلات الدقيقة التجارية التقليدية غير القابلة للذوبان15. أظهرت هذه الحاملة الدقيقة المسامية ثلاثية الأبعاد القابلة للذوبان من فئة GMP ، 3D TableTrix ، إمكانات كبيرة لإنتاج الخلايا على نطاق واسع. في الواقع ، يمكن لثقافة 3D القائمة على هذه الناقلات الدقيقة المسامية أن تعيد إنشاء بيئات دقيقة مواتية للمحاكاة الحيوية لتعزيز التصاق الخلايا وانتشارها وهجرتها وتنشيطها16. يمكن للهياكل المسامية وشبكات المسام المترابطة للناقلات الدقيقة أن تخلق منطقة التصاق أكبر للخلايا وتعزز تبادل الأكسجين والمغذيات والمستقلبات ، وبالتالي إنشاء ركيزة مثالية لتوسيع الخلايا في المختبر 17. تتيح المسامية العالية لهذه الناقلات الدقيقة المسامية القابلة للذوبان 3D من الدرجة GMP توسعا واسع النطاق ل hMSCs ، وتسمح القدرة على إذابة الخلايا بالكامل بالحصاد الفعال لهذه الخلايا الموسعة18. وهو أيضا منتج من الدرجة GMP وقد تم تسجيله كسواغ صيدلاني لدى المركز الصيني لتقييم الأدوية (أرقام الإيداع: F20210000003 و F20200000496)19 وإدارة الغذاء والدواء في الولايات المتحدة (FDA ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ FDA ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الولايات المخدرات الرئيسية رقم الملف: 35481)20.
هنا ، نوضح نظام إنتاج الخلايا الصناعية المغلقة الآلية (ACISCP)18 باستخدام هذه الناقلات الدقيقة المسامية القابلة للتشتت والقابلة للذوبان ل hMSC وخلية HEK293T وتوسيع خلية Vero. لقد حققنا توسعا ناجحا من مستويين ل hMSCs (128 توسعة تراكمية في 9 أيام) من مفاعل حيوي سعة 5 لتر إلى مفاعل حيوي سعة 15 لترا وحصلنا أخيرا على ما يصل إلى 1.1 × 1010 hMSCs من دفعة واحدة من الإنتاج. تم حصاد الخلايا عن طريق إذابة الناقلات الدقيقة تماما ، وتركيزها وغسلها وصياغتها باستخدام نظام معالجة الخلايا القائم على الطرد المركزي المستمر التدفق ، ثم تم اقتباسها بنظام تعبئة الخلايا. علاوة على ذلك ، قمنا بتقييم جودة منتجات hMSC لتأكيد الامتثال. لقد أظهرنا أيضا تطبيق هذه الناقلات الدقيقة القابلة للذوبان للإنتاج الموسع لنوعين آخرين من خلايا التثبيت ، خلايا HEK293T وخلايا Vero ، والتي يتم تطبيقها على نطاق واسع في صناعة CGT. بلغت ذروة كثافة الخلايا لخلايا HEK293T 1.68 × 10 7 خلايا / مل ، بينما بلغت ذروة كثافة خلايا Vero 1.08 × 107 خلايا / مل. يمكن تكييف نظام ACISCP لاستزراع مجموعة متنوعة من الخلايا الملتصقة ، ويمكن أن يصبح منصة قوية تساهم في تسريع تصنيع CGT.
Protocol
Representative Results
Discussion
يستخدم كل من العلاج المناعي والعلاج بالخلايا الجذعية الخلايا الحية كأدوية. ومع ذلك ، لا ينبغي تنقية منتجاتها النهائية أو تعقيمها بنفس طريقة الجزيئات الصغيرة أو الفيروسات. لذلك ، يجب دائما مراعاة مبدأ الجودة حسب التصميم (QbD) وتطبيقه عمليا على عملية التصنيع والتحكم الكيميائي (CMC) أثناء إنتاج…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم للعلماء الشباب المتميزين (82125018).
Materials
| 0.25% trypsin EDTA | BasalMedia | S310JV | Used for 2D cell harvest. |
| 3D FloTrix Digest | CytoNiche Biotech | R001-500 | This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers. |
| 3D FloTrix MSC Serum Free Medium | CytoNiche Biotech | RMZ112 | This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers. |
| 3D FloTrix Single-Use Filtration Module | CytoNiche Biotech | R020-00-10 | This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution. |
| 3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-03 | Used as feed bag for 5 L bioreactor. |
| 3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-01 | Used as cell seeding or transfer bags. |
| 3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-04 | Used as feed bag for 15 L bioreactor. |
| 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit | CytoNiche Biotech | PACK-01-01 | This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system. |
| 3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells | CytoNiche Biotech | vivaPACK | This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch. |
| 3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system | CytoNiche Biotech | vivaPREP PLUS | This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures. |
| 3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit | CytoNiche Biotech | PREP-PLUS-00 | This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing. |
| 3D FloTrix vivaSPIN bioreactor 15 L | CytoNiche Biotech | FTVS15 | This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available. |
| 3D FloTrix vivaSPIN bioreactor 5 L | CytoNiche Biotech | FTVS05 | This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available. |
| 3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L) | CytoNiche Biotech | R020-10-10 | This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags. |
| 3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L) | CytoNiche Biotech | R020-05-10 | This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags. |
| 3D TableTrix microcarriers G02 | CytoNiche Biotech | G02-10-10g | These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors. |
| 3D TableTrix microcarriers V01 | CytoNiche Biotech | V01-100-10g | These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production. |
| 3D TableTrix microcarriers W01 | CytoNiche Biotech | W01-10-10g (single-use packaging); W01-200 (tablets) |
These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481] |
| APC anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 368512 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment |
| Calcein-AM/PI Double Staining Kit | Dojindo | C542 | Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively. |
| Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) | Saint-Gobain | CAP-38 | Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands. |
| C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in) | Saint-Gobain | 374-250-3 | Used for tube welding and disconnection. |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit. |
| Dimethyl Sulfate (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | Used for preparation of cryopreservation solution. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | BasalMedia | L120KJ | Used for cultivation of HEK293T and Vero cells. |
| DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L) | DWK life sciences | 218016357 | Used for waste collection from the 5 L bioreactor. |
| DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L) | DWK life sciences | 218017353 | Used for waste collection from the 15 L bioreactor. |
| DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL) | DWK life sciences | 218014459 | Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH. |
| EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) | Saint-Gobain | EZ500 ML-38-2 | Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands. |
| Fetal bovine serum (FBS) superior quality | Wisent | 086-150 | Used for cultivation of HEK293T cells. |
| FITC anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 301804 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| FITC anti-human CD34 Antibody | BioLegend | 343504 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody | BioLegend | 328108 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| Flow cytometry | Beckman Coulter | CytoFLEX | Used for cell identity assessment. |
| Fluorescence Cell Analyzer | Alit life science | Countstar Rigel S2 | Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes. |
| GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports | DWK life sciences | 292632806 | Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands. |
| Glucose Meter | Sinocare | 6243578 | Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium | Gibco | 14025092 | Used for preparation of digest solution. |
| Human Albumin 20% Behring (HSA) | CSL Behring | N/A | Used for preparation of wash buffer. |
| Inverted fluorescent microscope | OLYMBUS | CKX53SF | Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging. |
| Nalgene Measuring Cylinder (500 mL) | Thermo Scientific | 3662-0500PK | Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps. |
| Newborn calf serum (NBS) superfine | MINHAI BIO | SC101.02 | Used for cultivation of Vero cells. |
| OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit | Cyagen | HUXUC-90031 | Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs. |
| OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit | Cyagen | HUXUC-90041 | Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs. |
| OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit | Cyagen | HUXUC-90021 | Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs. |
| PE anti-human CD105 Antibody | BioLegend | 800504 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| PE anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302208 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody | BioLegend | 344004 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| PE anti-human HLA-DR Antibody | BioLegend | 307605 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium. |
| Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in) | Saint-Gobain | ULTRA-C-125-2F | Used for solution transfering driven by peristaltic pumps. |
| Sterile Saline | Hopebiol | HBPP008-500 | Used for preparation of wash buffer. |
| Trypzyme Recombinant Trypsin | BasalMedia | S342JV | This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells. |
| Tube Sealer | Yingqi Biotech | Tube Sealer I | This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing. |
| Tube Welder for PVC tubing | Chu Biotech | Tube Welder Micro I | Used for welding of PVC tubing. |
| Tube Welder for TPE tubing | Yingqi Biotech | Tube Welder I-V2 | Used for welding of TPE tubing. |
| ViaStain AO / PI Viability Stains | Nexcelom | CS2-0106-25mL | Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris. |
References
- Golchin, A., Farahany, T. Z. Biological products: Cellular therapy and FDA approved products. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).
- Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. R. Durable cell and gene therapy potential patient and financial impact: US projections of product approvals, patients treated, and product revenues. Drug Discovery Today. 27 (1), 17-30 (2022).
- Elverum, K., Whitman, M. Delivering cellular and gene therapies to patients: solutions for realizing the potential of the next generation of medicine. Gene Therapy. 27 (12), 537-544 (2020).
- Blache, U., Popp, G., Dünkel, A., Koehl, U., Fricke, S. Potential solutions for manufacture of CAR T cells in cancer immunotherapy. Nature Communications. 13 (1), 5225 (2022).
- Lee, B., et al. Cell culture process scale-up challenges for commercial-scale manufacturing of allogeneic pluripotent stem cell products. Bioengineering. 9 (3), 92 (2022).
- Emerson, J., Glassey, J. Bioprocess monitoring and control: Challenges in cell and gene therapy. Current Opinion in Chemical Engineering. 34, 100722 (2021).
- Robb, K. P., Fitzgerald, J. C., Barry, F., Viswanathan, S. Mesenchymal stromal cell therapy: progress in manufacturing and assessments of potency. Cytotherapy. 21 (3), 289-306 (2019).
- Olsen, T. R., Ng, K. S., Lock, L. T., Ahsan, T., Rowley, J. A. Peak MSC-Are we there yet. Frontiers in Medicine. 5, 178 (2018).
- . Roots Analysis. Stem Cell Therapy Contract Manufacturing (CMO) Market, 2019 – 2030 Available from: https://www.rootsanalysis.com/reports/view_document/stem-cell-therapy-contract-manufacturing-market-2019-2030/271.html (2019)
- Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. The International Journal of Artificial Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Silva, d. a., L, C., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnology. 236, 88-109 (2016).
- Rafiq, Q. A., Coopman, K., Nienow, A. W., Hewitt, C. J. Systematic microcarrier screening and agitated culture conditions improves human mesenchymal stem cell yield in bioreactors. Biotechnology Journal. 11 (4), 473-486 (2016).
- Tavassoli, H., et al. Large-scale production of stem cells utilizing microcarriers: A biomaterials engineering perspective from academic research to commercialized products. Biomaterials. 181, 333-346 (2018).
- Mizukami, A., et al. Technologies for large-scale umbilical cord-derived MSC expansion: Experimental performance and cost of goods analysis. Biochemical Engineering Journal. 135, 36-48 (2018).
- Yan, X., et al. Dispersible and dissolvable porous microcarrier tablets enable efficient large-scale human mesenchymal stem cell expansion. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (5), 263-275 (2020).
- Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C., Haycock, J. W. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 17-39 (2011).
- Loh, Q. L., Choong, C. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering applications: Role of porosity and pore size. Tissue Engineering. Part B Reviews. 19 (6), 485-502 (2013).
- Zhang, Y., et al. GMP-grade microcarrier and automated closed industrial scale cell production platform for culture of MSCs. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 16 (10), 934-944 (2022).
- NMPA. Pharmaceutical Excipient Registration Database: Microcarrier tablets for cells. Center for Drug Evaluation Available from: https://www.cde.org.cn/main/xxgk/listpage/ba7aed094c29ae314670a3563a716e (2023)
- List of Drug Master Files (DMFs). US Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/drug-mater-files-dmfs/list-drug-master-files-dmfs (2023)
- Beeravolu, N., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224 (2017).
- Xie, Y., et al. The quality evaluation system establishment of mesenchymal stromal cells for cell-based therapy products. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 176 (2020).
- Maillot, C., Sion, C., De Isla, N., Toye, D., Olmos, E. Quality by design to define critical process parameters for mesenchymal stem cell expansion. Biotechnology Advances. 50, 107765 (2021).
- Silva Couto, P., et al. Expansion of human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs) in bioreactors using microcarriers: Lessons learnt and what the future holds. Biotechnology Advances. 45, 107636 (2020).
- Chen, S., et al. Facile bead-to-bead cell-transfer method for serial subculture and large-scale expansion of human mesenchymal stem cells in bioreactors. Stem Cells Translational Medicine. 10 (9), 1329-1342 (2021).
- Tsai, A. C., Pacak, C. A. Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors. Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).
- Hewitt, C. J., et al. Expansion of human mesenchymal stem cells on microcarriers. Biotechnology Letters. 33 (11), 2325-2335 (2011).
- Mawji, I., Roberts, E. L., Dang, T., Abraham, B., Kallos, M. S. Challenges and opportunities in downstream separation processes for mesenchymal stromal cells cultured in microcarrier-based stirred suspension bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 119 (11), 3062-3078 (2022).
- Schirmaier, C., et al. Scale-up of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell production in stirred single-use bioreactors under low-serum conditions. Engineering in Life Sciences. 14 (3), 292-303 (2014).
- Lawson, T., et al. Process development for expansion of human mesenchymal stromal cells in a 50L single-use stirred tank bioreactor. Biochemical Engineering Journal. 120, 49-62 (2017).
- Yang, J., et al. Large-scale microcarrier culture of HEK293T cells and Vero cells in single-use bioreactors. AMB Express. 9 (1), 70 (2019).
- Fang, Z., et al. Development of scalable vaccinia virus-based vector production process using dissolvable porous microcarriers. 25th Annual Meeting of the American Society of Gene & Cell Therapy. Molecular Therapy. 30, 195-196 (2022).
