Storskalig cellproduktion baserad på upplösbara porösa mikrobärare av GMP-kvalitet

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att uppnå storskalig tillverkning av vidhäftande celler genom ett helt slutet system baserat på upplösbara mikrobärare av GMP-kvalitet. Odlingen av humana mesenkymala stamceller, HEK293T-celler och Vero-celler validerades och uppfyllde både kvantitetskrav och kvalitetskriterier för cell- och genterapiindustrin.

Abstract

Forskare inom cell- och genterapiindustrin (CGT) har länge stått inför en formidabel utmaning i den effektiva och storskaliga expansionen av celler. För att ta itu med de primära bristerna i det tvådimensionella (2D) plana odlingssystemet utvecklade vi innovativt en automatiserad plattform för produktion av celler i industriell skala (ACISCP) baserad på en GMP-klassad, upplösbar och porös mikrobärare för 3D-odling av vidhäftande celler, inklusive humana mesenkymala stam-/stromaceller (hMSC), HEK293T-celler och Vero-celler. För att uppnå storskalig expansion genomfördes en tvåstegsexpansion med 5 L och 15 L omrörda tankbioreaktorer för att ge 1,1 x 10¹⁰ hMSC med en total 128-faldig expansion inom 9 dagar. Cellerna skördades genom att helt lösa upp mikrobärarna, koncentrerades, tvättades och formulerades med ett centrifugbaserat cellbearbetningssystem med kontinuerligt flöde och aliciterades sedan med ett cellfyllningssystem. Jämfört med 2D-plan kultur finns det inga signifikanta skillnader i kvaliteten på hMSC som skördas från 3D-kultur. Vi har också applicerat dessa upplösbara porösa mikrobärare på andra populära celltyper inom CGT-sektorn; specifikt har HEK293T celler och Vero-celler odlats till toppcelldensiteter på 1,68 x 10 7 celler/ml respektive 1,08 x 10⁷ celler/ml. Denna studie ger ett protokoll för att använda en bioprocessteknisk plattform som utnyttjar egenskaperna hos GMP-upplösbara mikrobärare och avancerad sluten utrustning för att uppnå industriell tillverkning av vidhäftande celler.

Introduction

CGT-industrin har bevittnat en exponentiell expansion under de senaste två decennierna. Utvecklingen av nästa generations läkemedel förväntas behandla och bota många refraktära sjukdomar¹. Sedan det första godkännandet från Food and Drug Administration (FDA) av en CGT-produkt, Kymriah, 2017 har CGT-relaterad forskning och utveckling i världen fortsatt att växa i snabb takt, och FDA har sett att antalet aktiva nya läkemedelsansökningar för CGT har ökat till 500 under 2018². Det hade förutspåtts att antalet godkännanden av CGT-produkter sannolikt kommer att vara 54-74 i USA år 2030².

Även om den snabba tillväxten inom CGT-forskning och innovation är spännande, finns det fortfarande en stor teknisk klyfta mellan laboratorieforskning och tillverkning i industriell skala som kan leverera dessa lovande läkemedel för att nå så många patienter som behövs till överkomliga kostnader. De nuvarande processerna som används för dessa kliniska prövningar etablerades i laboratorier för småskaliga experiment, och betydande ansträngningar krävs för att förbättra och förnya CGT-tillverkningen³. Det finns många typer av CGT-produkter, de flesta av dem baserade på levande celler, som kan vara allogena, autologa, konstruerade eller naturliga. Dessa levande läkemedel är mycket mer komplexa än små molekylära enheter eller biologiska läkemedel, vilket gör storskalig tillverkning till en betydande utmaning ^4,5,6. I detta arbete demonstrerar vi ett storskaligt cellproduktionsprotokoll för tre förankringsberoende celler som används i stor utsträckning i CGT. Dessa inkluderar humana mesenkymala stamceller/stromaceller (hMSC), som har använts för cellbaserad terapi, och HEK293T-celler och Vero-celler, som båda används för att producera virus för genteknik av den slutliga terapeutiska cellprodukten. Förankringsberoende celler odlas vanligtvis på plana system, som kräver manuell bearbetning. Manuella odlingsmetoder kräver dock en betydande mängd arbete och är benägna att kontamineras, vilket kan äventyra kvaliteten på slutprodukten. Dessutom finns det ingen in-line processkontroll, vilket leder till betydande variationer i kvalitet mellan batcher⁷. Om man tar stamcellsterapi som ett exempel, med en lovande pipeline på över 200 stamcellsterapikandidater, uppskattas det att 300 biljoner hMSC skulle behövas per år för att möta kraven från kliniska tillämpningar⁸. Därför har storskalig tillverkning av terapeutiska celler blivit en förutsättning för att utföra dessa terapeutiska ingrepp med ett så högt cellbehov⁹.

För att undvika bakslag för plana system har ansträngningar gjorts för att utveckla storskaliga tillverkningsprocesser i bioreaktorer med omrörda tankar med konventionella icke-upplösbara mikrobärare 10,11,12,13^, men dessa lider av komplicerade beredningsprocedurer och låg cellskördseffektivitet ¹⁴. Nyligen har vi utvecklat en upplösbar mikrobärare för stamcellsexpansion, i syfte att kringgå utmaningarna med cellskörd från konventionella icke-upplösbara kommersiella mikrobärare¹⁵. Denna nya, kommersiellt tillgängliga 3D-upplösbara porösa mikrobärare av GMP-kvalitet, 3D TableTrix, har visat stor potential för storskalig cellproduktion. Faktum är att 3D-odling baserad på dessa porösa mikrobärare potentiellt kan återskapa gynnsamma biomimetiska mikromiljöer för att främja cellvidhäftning, proliferation, migration och aktivering¹⁶. De porösa strukturerna och sammankopplade pornätverken hos mikrobärare kan skapa ett större celladhesionsområde och främja utbytet av syre, näringsämnen och metaboliter, vilket skapar ett optimalt substrat för in vitro cellexpansion¹⁷. Den höga porositeten hos dessa 3D-lösliga porösa mikrobärare av GMP-kvalitet möjliggör storskalig expansion av hMSC, och förmågan för cellerna att vara helt upplösta möjliggör effektiv skörd av dessa expanderade celler¹⁸. Det är också en GMP-klassad produkt och har registrerats som ett farmaceutiskt hjälpämne hos Chinese Center for Drug Evaluation (registreringsnummer: F20210000003 och F20200000496)¹⁹ och FDA i USA (FDA, USA; Läkemedelsverkets registreringsnummer: 35481)²⁰.

Här illustrerar vi ett automatiserat system för produktion av celler i industriell skala (ACISCP)¹⁸ som använder dessa dispergerbara och upplösbara porösa mikrobärare för hMSC, HEK293T cell och Vero-cellexpansion. Vi uppnådde en framgångsrik tvåstegsexpansion av hMSCs (128 kumulativ expansion på 9 dagar) från en 5 L bioreaktor till en 15 L bioreaktor och erhöll slutligen upp till 1,1 x 10¹⁰ hMSCs från en enda produktionssats. Cellerna skördades genom att helt lösa upp mikrobärarna, koncentrerades, tvättades och formulerades med ett kontinuerligt flöde centrifugbaserat cellbearbetningssystem och aliciterades sedan med ett cellfyllningssystem. Dessutom bedömde vi kvaliteten på hMSC-produkterna för att bekräfta överensstämmelse. Vi demonstrerade också tillämpningen av dessa upplösbara mikrobärare för uppskalad produktion av två andra typer av förankringsceller, HEK293T-celler och Vero-celler, som används i stor utsträckning inom CGT-industrin. Den maximala celltätheten för HEK293T celler nådde 1,68 x 10 7 celler/ml, medan den maximala densiteten för Vero-celler nådde 1,08 x 10⁷ celler/ml. ACISCP-systemet skulle kunna anpassas för att odla en mängd olika vidhäftande celler, och det skulle potentiellt kunna bli en kraftfull plattform som bidrar till att påskynda industrialiseringen av CGT.

Protocol

Den mänskliga navelsträngen erhölls från Beijing Tsinghua Changgeng Hospital. Alla procedurer och protokoll avseende förvärv, isolering och odling av humana mesenkymala stamceller från navelsträngen (UCMSC) utfördes med informerat samtycke och med godkännande av den etiska kommittén vid Beijing Tsinghua Changgeng Hospital (registreringsnummer 22035-4-02), och procedurerna och protokollen överensstämde med Helsingforsdeklarationen från 1964 och dess senare ändringar eller jämförbara etiska standarder….

Representative Results

ACISCP-plattformen är ett helt slutet system som använder en serie bioreaktorer med omrörda tankar för uppskalningsexpansion, ett cellbearbetningssystem för automatiserad cellskörd och cellformulering samt ett cellfyllningssystem (figur 1). Vidhäftande celler fäster vid de porösa mikrobärarna, som kan dispergeras i bioreaktorn, vilket uppnår suspenderad odling av vidhäftande celler. I enlighet med det beskrivna protokollet inokulerades först 2,5 x 10<…

Discussion

Både immunterapi och stamcellsterapi använder levande celler som läkemedel; Deras slutprodukter bör dock inte renas eller steriliseras på samma sätt som små molekyler eller virus. Därför bör principen om inbyggd kvalitet (Quality by Design, QbD) alltid hållas i åtanke och tillämpas praktiskt på processen för kemisk tillverkning och kontroll (CMC) under cellproduktion²³. Ett helt slutet cellodlingssystem, samt ett processsystem och ett fyllningssystem, anses företrädesvis uppfylla …

Materials

0.25% trypsin EDTA	BasalMedia	S310JV	Used for 2D cell harvest.
3D FloTrix Digest	CytoNiche Biotech	R001-500	This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free Medium	CytoNiche Biotech	RMZ112	This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration Module	CytoNiche Biotech	R020-00-10	This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-03	Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-01	Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-04	Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit	CytoNiche Biotech	PACK-01-01	This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells	CytoNiche Biotech	vivaPACK	This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system	CytoNiche Biotech	vivaPREP PLUS	This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit	CytoNiche Biotech	PREP-PLUS-00	This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 L	CytoNiche Biotech	FTVS15	This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 L	CytoNiche Biotech	FTVS05	This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L)	CytoNiche Biotech	R020-10-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L)	CytoNiche Biotech	R020-05-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02	CytoNiche Biotech	G02-10-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01	CytoNiche Biotech	V01-100-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01	CytoNiche Biotech	W01-10-10g (single-use packaging); W01-200 (tablets)	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 Antibody	BioLegend	368512	Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining Kit	Dojindo	C542	Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	CAP-38	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in)	Saint-Gobain	374-250-3	Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50	Miltenyi Biotec	200-074-400	Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO)	Sigma	D2650-100mL	Used for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	BasalMedia	L120KJ	Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L)	DWK life sciences	218016357	Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L)	DWK life sciences	218017353	Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL)	DWK life sciences	218014459	Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	EZ500 ML-38-2	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior quality	Wisent	086-150	Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 Antibody	BioLegend	301804	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 Antibody	BioLegend	343504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	BioLegend	328108	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometry	Beckman Coulter	CytoFLEX	Used for cell identity assessment.
Fluorescence Cell Analyzer	Alit life science	Countstar Rigel S2	Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports	DWK life sciences	292632806	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose Meter	Sinocare	6243578	Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium	Gibco	14025092	Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA)	CSL Behring	N/A	Used for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscope	OLYMBUS	CKX53SF	Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL)	Thermo Scientific	3662-0500PK	Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfine	MINHAI BIO	SC101.02	Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90031	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90041	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90021	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 Antibody	BioLegend	800504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 Antibody	BioLegend	302208	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344004	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307605	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Wisent	311-010-CL	Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in)	Saint-Gobain	ULTRA-C-125-2F	Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile Saline	Hopebiol	HBPP008-500	Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant Trypsin	BasalMedia	S342JV	This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube Sealer	Yingqi Biotech	Tube Sealer I	This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubing	Chu Biotech	Tube Welder Micro I	Used for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubing	Yingqi Biotech	Tube Welder I-V2	Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability Stains	Nexcelom	CS2-0106-25mL	Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.