Sojabohnen-Haarwurzeltransformation zur Analyse der Genfunktion

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll für die hocheffiziente Produktion von transgenen Sojabohnen-Haarwurzeln vor.

Abstract

Sojabohnen (Glycine max) sind eine wertvolle Nutzpflanze in der Landwirtschaft, die Tausende von industriellen Anwendungen hat. Sojabohnenwurzeln sind der primäre Ort der Interaktion mit bodenbürtigen Mikroben, die eine Symbiose eingehen, um Stickstoff und Krankheitserreger zu fixieren, was die Erforschung der Sojabohnenwurzelgenetik von größter Bedeutung für die Verbesserung der landwirtschaftlichen Produktion macht. Die genetische Transformation von Sojabohnenwurzeln (HRs) wird durch den Agrobacterium rhizogenes-Stamm NCPPB2659 (K599) vermittelt und ist ein effizientes Werkzeug zur Untersuchung der Genfunktion in Sojabohnenwurzeln, das von Anfang bis Ende nur 2 Monate dauert. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das die Methode zur Überexpression und zum Ausschalten eines Gens von Interesse in Sojabohnen-HRs beschreibt. Diese Methodik umfasst die Sterilisation von Sojabohnensaatgut, die Infektion von Keimblättern mit K599 sowie die Auswahl und Ernte genetisch transformierter HRs für die RNA-Isolierung und, falls erforderlich, Metabolitenanalysen. Der Durchsatz des Ansatzes reicht aus, um mehrere Gene oder Netzwerke gleichzeitig zu untersuchen und könnte die optimalen Engineering-Strategien bestimmen, bevor man sich auf langfristig stabile Transformationsansätze festlegt.

Introduction

Sojabohnen (Glycine max) gehören zu den wertvollsten Nutzpflanzen in der Landwirtschaft. Es hat Tausende von kommerziellen und industriellen Verwendungszwecken, wie z. B. Lebensmittel, Tierfutter, Öl und als Rohstoffquelle für die Herstellung¹. Seine Fähigkeit, eine symbiotische Beziehung mit stickstofffixierenden Bodenmikroorganismen, insbesondere Rhizobien, einzugehen, erhöht die Bedeutung der Untersuchung der Sojabohnengenetik^{weiter 2}. So kann beispielsweise die Feinabstimmung der Stickstofffixierungseigenschaften in Sojabohnenwurzeln zu einer Verringerung der Kohlenstoffemissionen führen und den Bedarf an Stickstoffdünger erheblich senken³. Daher hat das Verständnis der Genetik, die insbesondere Aspekte der Biologie der Sojabohnenwurzel steuert, breite Anwendungen in der Landwirtschaft und Industrie. In Anbetracht dieser Vorteile ist es wichtig, ein zuverlässiges Protokoll zur Analyse der Funktion von Sojabohnengenen zu haben.

Agrobacterium tumefaciens ist vielleicht das am häufigsten verwendete Werkzeug für die genetische Transformation von Pflanzen, da es in der Lage ist, Transfer-DNA (T-DNA) in das Kerngenom vieler Pflanzenarten zu integrieren. Wenn Agrobacterium eine Pflanze infiziert, überträgt es das tumorinduzierende (Ti) Plasmid in das Wirtschromosom, was zur Bildung eines Tumors an der Infektionsstelle führt. Die Agrobacterium-vermittelte Transformation wird seit Jahrzehnten häufig für die Genfunktionsanalyse und zur Modifikation von Pflanzenmerkmalen eingesetzt⁴. Obwohl jedes interessierende Gen durch A. tumefaciens-vermittelte Transformation leicht in Wirtspflanzenzellen übertragen werden kann, hat diese Methode mehrere Nachteile. Es ist zeitaufwändig, teuer und erfordert für viele Pflanzenarten, wie z. B. Sojabohnen, umfangreiches Fachwissen. Obwohl einige Sojabohnensorten durch den Keimblattknotenansatz unter Verwendung von A. tumefaciens transformiert werden können, erfordert die Ineffizienz dieses Ansatzes die Notwendigkeit einer alternativen genetischen Transformationstechnologie, die schnell und hocheffizient ist ^4,5. Auch ein Laie kann diese Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Haarwurzel-Transformationsmethode (HR) anwenden, um diese Nachteile zu überwinden.

Die HR-Transformation ist ein relativ schnelles Werkzeug, nicht nur für die Analyse der Genfunktion, sondern auch für biotechnologische Anwendungen, wie die Herstellung von spezialisierten Metaboliten und Feinchemikalien sowie komplexer bioaktiver Glykoproteine⁶. Die Herstellung von Sojabohnen-HRs erfordert kein umfangreiches Fachwissen, da sie durch Verwundung der Oberflächen von Keimblättern und anschließender Inokulation mit Agrobacterium rhizogenes⁷ erzeugt werden können. A. rhizogenes exprimiert Virulenzgene (Vir), die durch sein Ti-Plasmid kodiert werden, das seinen T-DNA-Abschnitt in das Genom von Pflanzenzellen überträgt, trägt und integriert und gleichzeitig das Wachstum der ektopischen Wurzeln stimuliert⁸.

Im Vergleich zu anderen Genexpressionssystemen für Sojabohnen, wie z. B. der Biolistik oder der A. tumefaciens-basierten Transformation von Gewebe-, Zell- und Organkulturen, weist das HR-Expressionssystem mehrere Vorteile auf. Erstens sind HRs genetisch stabil und werden schnell auf hormonfreien Medien produziert ^1,9,10. Darüber hinaus können HRs spezialisierte Metaboliten in Mengen produzieren, die den nativen Wurzeln entsprechen oder diese überschreiten^11,12. Diese Vorteile machen HRs zu einem wünschenswerten biotechnologischen Werkzeug für Pflanzenarten, die mit A. tumefaciens nicht kompatibel sind oder die spezielle Gewebekulturbedingungen benötigen, um kompatible Gewebe zu bilden. Die HR-Methode ist ein effizienter Ansatz zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen, der subzellulären Lokalisierung von Proteinen, der rekombinanten Proteinproduktion, der Phytoremediation, der Mutagenese und genomweiten Effekten unter Verwendung der RNA-Sequenzierung^13,14,15. Es kann auch verwendet werden, um die Produktion spezialisierter Metaboliten zu untersuchen, die in der Industrie von Wert sind, einschließlich Glyceollinen, die die Abwehr von Sojabohnen gegen den wichtigen mikrobiellen Krankheitserreger Phytophthora sojae behandeln und beim Menschen beeindruckende krebshemmende und neuroprotektive Wirkungen haben^16,17.

Dieser Bericht demonstriert ein einfaches, effizientes Protokoll zur Herstellung von HRs für Sojabohnen. Im Vergleich zu früheren HR-Transformationsmethoden bietet dieses Protokoll eine signifikante (33%-50%) Verbesserung der HR-Bildung, indem A. rhizogenes-Transformanten vor der Inokulation von Sojabohnen-Keimblättern auf das Vorhandensein des Ti-Plasmids voruntersucht werden. Wir demonstrieren die Anwendbarkeit dieses Protokolls, indem wir mehrere binäre Vektoren transformieren, die Sojabohnen-Transkriptionsfaktor-Gene überexprimieren oder stilllegen.

Protocol

Anmerkungen: Es wird empfohlen, alle weiteren Schritte unter sterilen Bedingungen durchzuführen. 1. Sterilisation von Sojabohnensamen Legen Sie in einer Biosicherheitswerkbank 16-20 runde Williams 82-Sojabohnensamen in makellosem Zustand (d. h. ohne Risse oder Schönheitsfehler) in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 30 ml 70%igen Isopropylalkohol hinzu, schütteln Sie ihn 30 Sekunden lang vorsichtig und dekantieren Sie dann den Alkohol. S…

Representative Results

Die repräsentativen Ergebnisse stammen aus den veröffentlichten Daten19,20. Die Ergebnisse der Kolonie-PCR (cPCR) des transformierten K599 Agrobacterium sind in Abbildung 1 dargestellt. Wie die positiven Kolonien in Abbildung 1 zeigen, wurde das interessierende Gen mittels cPCR nachgewiesen (Abbildung 1A). Ein Drittel bis die Hälfte der Kolonien waren jedoch nega…

Discussion

In den letzten zehn Jahren wurde die HR-Methode der Sojabohne als leistungsfähiges Werkzeug entwickelt, um Gene zu untersuchen, die an der Stickstofffixierung 22,23, der biotischen und abiotischen Stresstoleranz ^24,25 und den Biosynthesewegen von Metaboliten beteiligt sind ^26,27. Das Wissen darüber, wie Pflanzen Metaboliten produzieren, hat eine…

Materials

Acetosyringone	Cayman	23224
Bleach	lavo	21124
DMSO	Fisher bioreagents	195679
Gelzan	Phytotech	HYY3251089A
Hygromycin	Phytotech	HHA0397050B
Isopropyl alcohol	Fisher chemical	206462
Kanamycin	Phytotech	SQS0378007G
LB powder	Fisher bioreagents	200318
MS powder	Caisson labs	2210001
Na2HPO4	Fisher bioreagents	194171
NaCl	Fisher chemical	192946
Petri dishes	Fisherbrand	08-757-11	100 mm x 25 mm
Phosphinothricin	Cedarlane	P034-250MG
REDExtract-N-Amp PCR Kit	Sigma	R4775
Sucrose	Bioshop	2D76475
Timentin	Caisson labs	12222002
Vitamins	Caisson labs	2211010