यहाँ वर्णित उनके यांत्रिक उत्तेजना के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल के बाद मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से endothelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सरल कार्यप्रवाह है. यह एंडोथेलियल कोशिकाओं के विकासात्मक मेकेनोबायोलॉजी के अध्ययन की अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण यांत्रिक उत्तेजना के बाद संस्कृति चिप से एकत्र जीवित कोशिकाओं के डाउनस्ट्रीम assays के साथ संगत है।
हृदय विकास के दौरान कार्यात्मक रूप से स्थापित होने वाला पहला अंग है, इस प्रकार गर्भधारण में बहुत पहले रक्त परिसंचरण शुरू होता है। भ्रूण के विकास को सुनिश्चित करने के लिए ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के परिवहन के अलावा, भ्रूण परिसंचरण यांत्रिक संकेतों के माध्यम से एंडोथेलियल परत के भीतर होने वाली कई महत्वपूर्ण विकास संबंधी घटनाओं को नियंत्रित करता है। बायोमैकेनिकल सिग्नल रक्त वाहिका संरचनात्मक परिवर्तनों को प्रेरित करते हैं, धमनीशिरापरक विनिर्देश स्थापित करते हैं, और हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं के विकास को नियंत्रित करते हैं। विकासशील ऊतकों की दुर्गमता प्रारंभिक मानव विकास में परिसंचरण की भूमिका की समझ को सीमित करती है; इसलिए, इन विट्रो मॉडल पोत मेकेनोबायोलॉजी के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। यह पत्र मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है और यांत्रिक संकेतों के प्रति उनकी प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक तरल पदार्थ में उनके बाद के बीजारोपण का वर्णन करता है। यह दृष्टिकोण यांत्रिक उत्तेजना के तहत एंडोथेलियल कोशिकाओं की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए अनुमति देता है, इसके बाद फेनोटाइपिकल और कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए एंडोथेलियल कोशिकाओं की पुनर्प्राप्ति होती है। यहां स्थापित इन विट्रो मॉडल इंट्रासेल्युलर आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण होगा जो यांत्रिक संकेतों द्वारा मध्यस्थता वाले सिग्नलिंग को स्थानांतरित करता है, जो अंततः मानव भ्रूण जीवन के दौरान पोत विकास को ऑर्केस्ट्रेट करता है।
भ्रूण के विकास के दौरान, हृदय कार्यक्षमता1 स्थापित करने वाला पहला अंग है, जिसमें एंडोकार्डियल ट्यूब गठन2 के शुरुआती चरण से पता लगाने योग्य संकुचन होते हैं। परिसंचरण, पोत के भीतर रक्त के प्रवाह द्वारा मध्यस्थता यांत्रिक संकेतों के साथ, प्रारंभिक विकास के कई महत्वपूर्ण पहलुओं को नियंत्रित करता है। भ्रूण परिसंचरण स्थापना से पहले, वास्कुलचर को प्राथमिक केशिका जाल में व्यवस्थित किया जाता है; हृदय के कामकाज पर, यह प्लेक्सस शिरापरक और धमनी वास्कुलचर3 में पुनर्गठित होता है। धमनीशिरापरक विनिर्देश में यांत्रिक संकेतों की भूमिका रक्त प्रवाह दीक्षा से पहले धमनी और शिरापरक मार्करों की पैन-एंडोथेलियल अभिव्यक्ति द्वारा परिलक्षित होती है4.
हेमोडायनामिक बल न केवल वास्कुलचर के विकास को नियंत्रित करते हैं, बल्कि रक्त कोशिका निर्माण के नियंत्रण में भी मौलिक भूमिका निभाते हैं। हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाएं (एचएसपीसी) हेमोजेनिक एंडोथेलियम 5,6,7,8 नामक विशेष एंडोथेलियल कोशिकाओं से निकलती हैं, जो विशेष रूप से विकास के प्रारंभिक चरण में भ्रूण के विभिन्न शारीरिक क्षेत्रों में मौजूद होती हैं। दिल की कमी वाले मॉडल, इन विट्रो मॉडल के साथ, यह प्रदर्शित किया है कि यांत्रिक संकेत हेमोजेनिक एंडोथेलियम 9,10,11,12,13,14 से एचएसपीसी उत्पादन को निर्देश देते हैं और बढ़ाते हैं।
विभिन्न प्रकार के प्रवाह गतिशीलता को अलग-अलग सेल चक्र15 को नियंत्रित करने के लिए दिखाया गया है, जिसे हेमोजेनिक एंडोथेलियम 16,17 और धमनी सेल विनिर्देश18 दोनों में महत्वपूर्ण माना जाता है। कुल मिलाकर, यांत्रिक संकेत विकास के दौरान सेल पहचान और कार्य के महत्वपूर्ण निर्धारक हैं। इन विट्रो फ्लुइडिक उपकरणों में उपन्यास हमें विवो में मानव रक्त विकास के दौरान विकासात्मक मैकेनोबायोलॉजी का अध्ययन करने से जुड़ी सीमाओं को दूर करने की अनुमति देता है।
इस पांडुलिपि में प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य का वर्णन करने के लिए है, कदम दर कदम, प्रयोगात्मक पाइपलाइन मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से इन विट्रो में व्युत्पन्न मानव endothelial कोशिकाओं पर कतरनी तनाव के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए (hiPSCs). इस प्रोटोकॉल endothelial कोशिकाओं में hiPSCs के भेदभाव और उत्तेजना प्रोटोकॉल के लिए तरल पदार्थ चिप्स में उनके बाद के बोने पर विस्तृत निर्देश शामिल हैं. इसका उपयोग करते हुए, इन विट्रो-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं में अलग-अलग प्रवाह के जवाब में उनके अभिविन्यास का विश्लेषण करके कतरनी तनाव को समझने की उनकी क्षमता के लिए परीक्षण किया जा सकता है। यह अन्य प्रयोगशालाओं को कतरनी तनाव की प्रतिक्रिया और विभिन्न एंडोथेलियल सेल पहचान पर इसके कार्यात्मक परिणामों के बारे में सवालों को संबोधित करने की अनुमति देगा।
प्रोटोकॉल है कि हम यहाँ वर्णन मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से mechanosensitive endothelial कोशिकाओं की पीढ़ी और नियंत्रित कतरनी तनाव द्वारा मध्यस्थता यांत्रिक उत्तेजना के लिए उनकी प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. यह प्रोटोकॉल पूरी तरह से साइटोकाइन आधारित है और सेल थेरेपी के लिए कोशिकाओं के उत्पादन में संभावित अनुवाद के लिए जीएमपी अभिकर्मकों के साथ पूरी तरह से संगत है।
HIPSCs की व्युत्पत्ति भ्रूण के विकास के शुरुआती चरणों के लिए एक वाद्य मॉडल के साथ वैज्ञानिकों को प्रदान करती है जो प्रक्रियाओं के अध्ययन को सक्षम बनाती है जो अन्यथा विवो24 में अध्ययन करना मुश्किल है। वास्तव में, अनुसंधान के लिए उपलब्ध मानव भ्रूण के ऊतकों को संचलन की कमी वाले भ्रूण से एकत्र किया जाता है, और इसका यांत्रिक संकेतों द्वारा नियंत्रित आणविक हस्ताक्षर पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है। यहां वर्णित दृष्टिकोण कतरनी तनाव के लिए सेल प्रतिक्रिया के लाइव-इमेजिंग और वास्तविक समय के अध्ययन को सक्षम बनाता है। तरल पदार्थ के साथ hiPSCs के संयोजन सीमित उपलब्धता और विकासशील भ्रूण के ऊतकों की दुर्गमता पर काबू पाने कि अध्ययन का एक मॉडल प्रदान करता है जब परिसंचरण remodels की दीक्षा remodels और हृदय और रक्त प्रणाली 3,9,10,25 की स्थापना को नियंत्रित करता है.
प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि इस प्रोटोकॉल से प्राप्त एंडोथेलियल कोशिकाएं विकासशील ऊतकों में मौजूद विभिन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं की विभिन्न पहचानों को प्रतिबिंबित नहीं कर सकती हैं। इस सीमा को दूर करने के लिए, वांछित पहचान या ऊतक-विशिष्ट फेनोटाइप26 प्राप्त करने के लिए द्रव उत्तेजना से पहले भेदभाव प्रक्रिया के दौरान साइटोकिन्स के एक विशिष्ट संयोजन की आवश्यकता हो सकती है। अलगाव चरण के दौरान एंडोथेलियल सबसेट का अलगाव अधिक परिष्कृत इम्यूनोफेनोटाइप का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल केवल सीडी 34 की अभिव्यक्ति के आधार पर एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करता है, जिससे प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) के बजाय कॉलम अलगाव की अनुमति मिलती है; यह कोशिका मृत्यु और संदूषण के जोखिम को कम करता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से लामिना का प्रवाह द्वारा मध्यस्थता कतरनी तनाव की भूमिका का अध्ययन करने के लिए बनाया गया है. वैकल्पिक द्रव दृष्टिकोण को अन्य यांत्रिक संकेतों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए नियोजित करना होगा, जैसे कि खिंचाव या संपीड़न, या अन्य प्रकार के प्रवाह जैसे कि परेशान या परेशान प्रवाह।
हम पहले से पता चला है कि IPSC व्युत्पन्न endothelial कोशिकाओं विषम धमनीशिरापरक सेलुलर पहचान की नकल27 भ्रूण पृष्ठीय महाधमनी 28,29,30 में मनाया है कि इसी तरह. यह पोत विकास और सेलुलर विनिर्देश के संदर्भ में विशेष महत्व का है, जिसे रक्त परिसंचरण द्वारा नियंत्रित किया जाना जाता है। विभिन्न मॉडलों में अध्ययन से पता चला है कि परिसंचरण की कमी के परिणामस्वरूप धमनीशिरापरक विनिर्देश 11,14,31में परिवर्तन होता है। सेल विनिर्देश के साथ यांत्रिक संकेतों को जोड़ने वाले तंत्र अभी भी अज्ञात हैं और यहां वर्णित पाइपलाइन परिष्कृत कार्यात्मक अध्ययनों की अनुमति देती है जिन्हें विवो में परीक्षण नहीं किया जा सकता है।
इस पाइपलाइन उत्पादन और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तरल पदार्थ चैनलों का उपयोग hiPSCs से व्युत्पन्न endothelial कोशिकाओं की उत्तेजना का वर्णन करता है, व्यापक रूप से इस्तेमाल polydimethylsiloxane (PDMS) उपकरणों12 के लिए के रूप में उपकरणों कास्टिंग के लिए की आवश्यकता से परहेज. इसके अलावा, पीडीएमएस चिप्स का उपयोग उत्तेजित कोशिकाओं के संग्रह को विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण बनाता है, जबकि इस प्रोटोकॉल के साथ, कोशिकाओं को आसानी से चैनल से पुनः प्राप्त किया जा सकता है। यह विश्लेषणात्मक शक्ति में काफी सुधार करता है जो बाद के विश्लेषण जैसे प्रोटिओमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण, प्रवाह साइटोमेट्री और कार्यात्मक परख के लिए अनुमति देता है, जिसे आगे संस्कृति या विवो परख की आवश्यकता हो सकती है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को यूरोपियन हेमेटोलॉजी एसोसिएशन से रिसर्च एडवांस्ड ग्रांट 2021, अमेरिकन सोसाइटी ऑफ हेमेटोलॉजी से ग्लोबल रिसर्च अवार्ड 2021 और वेलकम ट्रस्ट और एडिनबर्ग विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित आंतरिक रणनीति सहायता कोष ISSF3 द्वारा समर्थित किया गया था। हम फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण में समर्थन के लिए फ्लो साइटोमेट्री सुविधा से फियोना रॉसी को धन्यवाद देते हैं। खुली पहुंच के उद्देश्य के लिए, लेखक ने इस सबमिशन से उत्पन्न होने वाले किसी भी लेखक स्वीकृत पांडुलिपि संस्करण के लिए क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन (सीसी बाय) लाइसेंस लागू किया है।
0.6 Luer uncoated slide | ibidi | IB-80186 | |
25% BSA | Life Technologies | A10008-01 | |
6-well plates | Greiner Bio-one | 657160 | |
Accutase | Life Technologies | A1110501 | Cited as Dissociation reagent |
Ascorbic acid | Merck | A4544-100G | |
Aspiration pipette | Sardtedt | 86.1252.011 | |
B27 supplement | Life Technologies | 17504044 | Cited as Neuronal cell culture supplement (50x) |
BD FACS DIVA | BD Biosciences | Version 8.0.1 | Cited as flow cytometry software |
BD LSR Fortessa 5 Laser | BD Biosciences | ||
bFGF | Life Technologies | PHG0021 | |
CD34 Microbead kit | Miltenyil Biotec | 30-046-702 | |
CD34 PE clone 4H11 | Invitrogen | 12-0349-42 | |
CD34 PerCP-eFluor 710 clone 4H11 | Invitrogen | 44-0349-42 | |
Cellstar cell-repellent surface 6-well plates | Greiner Bio-one | 657970 | Cited as cell-repellent plate |
CHIR99021 | Cayman Chemicals | 13122-1mg-CAY | |
Cryostor CS10 cell cryopreservation | Merck | C2874-100ML | Cited as Cryopreservation solution |
Dimethyl Sulfoxide | VWR | 200-664-3 | Cited as DMSO |
DMEM/F-12 | Life Technologies | 10565-018 | |
DPB Ca2+ Mg2+ | Life Technologies | 14080055 | |
DPBS | Life Technologies | 14200075 | |
EASY Strainer 40 μm | Greiner Bio-one | 542040 | |
EDTA | Life technologies | 15575020 | |
FcR Blocking Reagent | Miltenyil Biotec | 130-059-901 | |
Fiji | Version 1.53c | ||
Flow Jo | Version 10.7.1 | Cited as flow cytometry sanalysis oftware | |
FLT3L | Peprotech | 300-19-10uG | |
Fluidic unit | ibidi | 10903 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | Cited as L-glutamine supplement |
Ham F-12 | Life Technologies | 11765054 | |
Holo-transferrin | Merk | T0665-500MG | |
Human Serum Albumin | Fujifilm UK LTD | 9988 | |
Ibidi Pump system | ibidi | 10902 | Cited as Pump system |
IMDM | Life Technologies | 12440053 | |
Inverted microscope | ioLight/Thisle Scientific | IOL-IO-INVERT | Cited as inverted in-incubator microscope |
Lyophilised BSA | Merck | A2153-100G | |
MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | Cited as Magnetic separator |
MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | Cited as Magnetic column |
MTG | Merck | M6145-25ML | |
N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
Notebook for pump system | ibidi | 10908 | |
Paraformaldehyde 37-41% | Fisher Chemicals | F/1501/PB15 | |
Pastette | Greiner Bio-one | 612398 | |
Pen/Strep | Gibco | 15070063 | |
Perfusion Set YELLOW/GREEN: 50 cm, ID 1.6 mm, 10 mL reservoirs | Ibidi | IB-10964 | Cited as Perfusion set |
Polystyrene Round Bottom Tubes | Falcon | 352008 | Cited as Flow cytometry tubes |
Prism 9 | Verison 9.4.0 | ||
Pump control software | ibidi | version 1.6.1 | Cited as Pump software |
ReLeSR | Stem cell tecchonologies | 5872 | Cited as Detaching solution |
rhBMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
rhEPO | R&D | 287-TC-500 | |
rhIGF1 | Peprotech | 100-11-100uG | |
rhIL11 | Peprotech | 200-11-10uG | |
rhIL3 | Peprotech | 200-03-10uG | |
rhIL6 | R&D | 206-IL-010 | |
rhLaminin-521 | Life technologies | A29248 | Cited as Laminin |
rhSCF | Life Technologies | PHC2111 | |
rhTPO | R&D | 288-TPN-025 | |
rhVEGF | R&D | 293-VE-010 | |
RLT Lysis Buffer | Qiagen | 79216 | |
Serial Connector for µ-Slides: Sterile, Sterile | ibidi | IB-10830 | |
StemPro-CD34 SFM media | Life Technologies | 10639011 | Cited as Serum-Free media for CD34+ cells (SFM-34) |
StemPro-CD34 Nutrient Supplement | Life Technologies | 10641-025 | Cited as 34 nutrient supplement |
StemPro hESC SFM | Life Technologies | A1000701 | Cited as Culture media |
StemPro supplement | Life Technologies | A10006-01 | |
Vitronectin (VTN-N) recombinant human protein, truncated | Invitrogen | A31804 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Cited as iRock |
β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |