Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Mitochondrienfunktion in menschlichen Spermien

Summary

Die Analyse der Mitochondrienfunktion von Spermien mittels hochauflösender Respirometrie ermöglicht die Messung des Sauerstoffverbrauchs von frei beweglichen Spermien in einem geschlossenen Kammersystem. Die Technik kann zur Messung der Atmung in menschlichen Spermien eingesetzt werden, die Informationen über die mitochondrialen Eigenschaften und die Integrität der Spermien liefert.

Abstract

Die Samenqualität wird oft durch eine routinemäßige Samenanalyse untersucht, die beschreibend und oft nicht schlüssig ist. Männliche Unfruchtbarkeit ist mit einer veränderten mitochondrialen Aktivität der Spermien verbunden, so dass die Messung der mitochondrialen Funktion der Spermien ein Indikator für die Spermienqualität ist. Die hochauflösende Respirometrie ist eine Methode zur Messung des Sauerstoffverbrauchs von Zellen oder Geweben in einem geschlossenen Kammersystem. Diese Technik kann zur Messung der Atmung in menschlichen Spermien eingesetzt werden und liefert Informationen über die Qualität und Integrität der Spermienmitochondrien. Die hochauflösende Respirometrie ermöglicht es den Zellen, sich frei zu bewegen, was bei Spermien a priori von Vorteil ist. Diese Technik kann mit intakten oder permeabilisierten Spermien angewendet werden und ermöglicht die Untersuchung der intakten Mitochondrienfunktion der Spermien und der Aktivität einzelner Atmungskettenkomplexe. Das hochauflösende Oxygraph-Gerät verwendet Sensoren zur Messung der Sauerstoffkonzentration in Verbindung mit einer empfindlichen Software zur Berechnung des Sauerstoffverbrauchs. Die Daten werden verwendet, um Atmungsindizes auf der Grundlage der Sauerstoffverbrauchsverhältnisse zu berechnen. Folglich sind die Indizes die Anteile von zwei Sauerstoffverbrauchsraten und werden intern auf die Zellzahl oder Proteinmasse normiert. Die Atmungsindizes sind ein Indikator für die mitochondriale Funktion und Dysfunktion der Spermien.

Introduction

Es wird geschätzt, dass männliche Unfruchtbarkeit 40%-50% aller Fälle von Unfruchtbarkeit bei Paaren ausmacht¹. Die konventionelle Samenanalyse spielt eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der männlichen Fruchtbarkeit. Etwa 15 % der unfruchtbaren Männer haben jedoch normale Spermienparameter². Darüber hinaus liefert die routinemäßige Samenanalyse nur begrenzte Informationen über die Spermienfunktion und spiegelt keine subtilen Spermiendefekte wider³.

Spermienmitochondrien haben eine besondere Struktur, da sie als spiralförmige Hülle um die Geißeln angeordnet sind. Die mitochondriale Hülle enthält eine variable Anzahl von Mitochondrien, die durch intermitochondriale Linker verbunden und durch geordnete Proteinanordnungen auf der äußeren Mitochondrienmembran mit dem Zytoskelett verankert sind ^4,5. Diese Struktur macht es besonders schwierig, die Mitochondrien der Spermien zu isolieren. Daher werden in den meisten Studien zur mitochondrialen Funktion von Spermien In-situ-Analysen oder demembranierte Spermien verwendet⁶.

Die mitochondriale Struktur und Funktion der Spermien wurde konsistent mit männlicher Unfruchtbarkeit in Verbindung gebracht 7,8,9,10,11, was darauf hindeutet^, dass die Analyse der Struktur und Funktion dieser Organellen ein guter Kandidat für die Einbeziehung in die Spermienanalyse sein könnte.

Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle im zellulären Energiestoffwechsel, insbesondere durch die Verwendung von Sauerstoff zur Herstellung von Adenosintriphosphat (ATP) durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS). Insbesondere bei Spermien ist die Quelle von ATP (Glykolyse vs. OXPHOS) umstritten, und viele der Daten bleiben umstritten und hängen von verschiedenen experimentellen Ansätzen ab 4,12,13. Messungen der Atmung mittels Oximetrie bieten signifikante Einblicke in die mitochondriale Atmungskapazität, die mitochondriale Integrität und den Energiestoffwechsel der Zelle^14,15,16. Traditionell wurde diese Technik mit der Clark-Sauerstoffelektrode durchgeführt – einem Instrument, das seit mehr als 50 Jahren zur Messung der mitochondrialen Atmung verwendet wird^17,18. Darüber hinaus wurde der mitochondriale Sauerstoffverbrauch der Spermien mit der klassischen Clark-Sauerstoffelektrode 19,20,21 analysiert. Die hochauflösende Respirometrie (HRR) mit Oxygraphen (Oroboros) bietet eine höhere Sensitivität als die Verwendung klassischer Respirometriegeräte²². Die Oxygraphen bestehen aus zwei Kammern mit Injektionsanschlüssen, und jede Kammer verfügt über einen polarographischen Sauerstoffsensor. Mit dieser Technik ist es möglich, Gewebeobjektträger, Zellen und isolierte mitochondriale Suspensionen zu analysieren. Die Probe wird in der Kammer kontinuierlich gerührt, und während des Experiments wird der Sauerstoffverbrauch gemessen und die Sauerstoffraten mit einer speziellen Software berechnet. Die Kammern weisen eine reduzierte Sauerstoffleckage auf, was ein Vorteil gegenüber den herkömmlichen Sauerstoffelektrodenvorrichtungen^14,23 ist.

Wie bei anderen Zellen ist auch bei Spermien die Empfindlichkeit der HRR-Geräte höher als bei der herkömmlichen Respirometrie, was bedeutet, dass HRR-Geräte für die Analyse einer begrenzten Anzahl intakter oder permeabilisierter Samenzellen verwendet werden können. Es gibt zwei Hauptstrategien zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion von Spermien mittels HRR: (a) Messung des Sauerstoffverbrauchs in intakten Zellen, bei der die Atmungsfunktion in einem Medium, das Substrate wie Glukose enthält, reproduziert wird, oder (b) Messung des Sauerstoffverbrauchs in permeabilisierten Zellen unter Verwendung eines der OXPHOS-Komplexe, wobei spezifische Substrate hinzugefügt werden, um jede Funktion separat zu überwachen.

In der vorliegenden Studie beschreiben wir den Einsatz von HRR zur Bestimmung der mitochondrialen Atmung in menschlichen Samenzellen.

Protocol

Die Experimente wurden von der Ethikkommission der Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay, genehmigt. Abbildung 1: Arbeitsablauf für hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion in intakten und permeabilisierten menschlichen Spermien. Das Protokoll wurde…

Representative Results

Bestimmung der optimalen Konzentration von Digitonin in SamenzellenIn diesem Protokoll stellen wir die Verwendung von HRR vor, um Veränderungen von OXPHOS in menschlichen Samenzellen in Echtzeit zu überwachen. Da die Methode zur Analyse von intakten oder Digitonin-permeabilisierten Spermien verwendet werden kann, stellen wir zunächst die Standardisierung der Digitoninkonzentration vor, die für die Permeabilisierung von Spermien erforderlich ist (Abbildung 3). <p …

Discussion

Die HRR hängt entscheidend von mehreren Schritten ab: (a) der Wartung der Geräte, (b) der genauen Kalibrierung der Sauerstoffsensoren, (c) der Entkopplertitration²⁶ und schließlich (d) der angemessenen Verwendung von Indizes, die die mitochondriale Funktion darstellen. Die Wartung der Geräte ist von entscheidender Bedeutung. Es wird empfohlen, die Membranen des polarographischen Sauerstoffsensors regelmäßig auszutauschen und den instrumentellen Untergrund zu korrigieren. Ein ausgiebiges Wasc…

Materials

Acid free- Bovine serum albumine	Sigma Aldrich	A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma Aldrich	A5285
Animycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920
DatLab sofware version 4,2	Oroboros Instruments GmbH	N/A
D-glucose	Sigma Aldrich	G7021
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L malic acid	Sigma Aldrich	M1000
Magnesium sulphate	Sigma Aldrich	M7506
Microliter Syringes	Hamilton	87900 or 80400
Microscope camera	Basler	acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+	Nikon	N/A
Monopotassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
MOPS	Sigma Aldrich	M1254
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Oxygraph-2 K	Oroboros Instruments GmbH	N/A
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911
Power O2k-Respirometer	Oroboros Intruments	10033-01
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium lactate	Sigma Aldrich	L7022
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research	Microptic	N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600	Millennium Sciences CELL-VU	N/A
Succinate disodium salt	Sigma Aldrich	W327700