मानव शुक्राणु में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसन मिथुमी
Summary
उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वासरोमिति द्वारा शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का विश्लेषण एक बंद-कक्ष प्रणाली में स्वतंत्र रूप से चलने वाले शुक्राणुओं की ऑक्सीजन खपत के माप की अनुमति देता है। तकनीक को मानव शुक्राणु में श्वसन को मापने के लिए लागू किया जा सकता है, जो शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल विशेषताओं और अखंडता पर जानकारी प्रदान करता है।
Abstract
वीर्य की गुणवत्ता का अध्ययन अक्सर नियमित वीर्य विश्लेषण द्वारा किया जाता है, जो वर्णनात्मक और अक्सर अनिश्चित होता है। पुरुष बांझपन परिवर्तित शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि से जुड़ा हुआ है, इसलिए शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का माप शुक्राणु की गुणवत्ता का एक संकेतक है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमिति एक बंद-कक्ष प्रणाली में कोशिकाओं या ऊतकों की ऑक्सीजन की खपत को मापने की एक विधि है। इस तकनीक को मानव शुक्राणु में श्वसन को मापने के लिए लागू किया जा सकता है और शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रिया की गुणवत्ता और अखंडता के बारे में जानकारी प्रदान करता है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वासरोमिति कोशिकाओं को स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति देती है, जो शुक्राणु के मामले में एक प्राथमिक लाभ है। इस तकनीक को बरकरार या परमेबिलाइज्ड शुक्राणु के साथ लागू किया जा सकता है और बरकरार शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और व्यक्तिगत श्वसन श्रृंखला परिसरों की गतिविधि के अध्ययन की अनुमति देता है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन ऑक्सीग्राफ उपकरण ऑक्सीजन की खपत की गणना करने के लिए संवेदनशील सॉफ्टवेयर के साथ युग्मित ऑक्सीजन एकाग्रता को मापने के लिए सेंसर का उपयोग करता है। डेटा का उपयोग ऑक्सीजन खपत अनुपात के आधार पर श्वसन सूचकांक की गणना करने के लिए किया जाता है। नतीजतन, सूचकांक दो ऑक्सीजन खपत दरों के अनुपात हैं और आंतरिक रूप से सेल संख्या या प्रोटीन द्रव्यमान के लिए सामान्यीकृत हैं। श्वसन सूचकांक शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और शिथिलता का एक संकेतक हैं।
Introduction
जोड़ों में बांझपन के सभी मामलों में पुरुष बांझपन 40% -50% के लिए जिम्मेदार होने का अनुमान है। पारंपरिक वीर्य विश्लेषण पुरुष प्रजनन क्षमता को निर्धारित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है; हालांकि, लगभग 15% पुरुषों में सामान्य शुक्राणु पैरामीटर2 होते हैं। इसके अलावा, नियमित वीर्य विश्लेषण शुक्राणु समारोह के बारे में सीमित जानकारी प्रदान करता है और सूक्ष्म शुक्राणु दोषों को प्रतिबिंबित नहीं करताहै।
शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रिया में एक विशेष संरचना होती है, क्योंकि उन्हें फ्लैगेला के चारों ओर एक पेचदार म्यान के रूप में व्यवस्थित किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रियल म्यान में इंटरमाइटोकॉन्ड्रियल लिंकर द्वारा जुड़े माइटोकॉन्ड्रिया की एक चर संख्या होती है और बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली 4,5 पर प्रोटीन व्यवस्था के आदेश से साइटोस्केलेटन में लंगर डाला जाता है। यह संरचना शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करना विशेष रूप से मुश्किल बनाती है। इसलिए, शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के अधिकांश अध्ययन सीटू विश्लेषण या डिमेम्ब्रेनेटेड शुक्राणु6 में उपयोग करते हैं।
शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल संरचना और कार्य को लगातार पुरुष बांझपन 7,8,9,10,11 से जोड़ा गया है, यह सुझाव देते हुए कि इन ऑर्गेनेल की संरचना और कार्य का विश्लेषण शुक्राणु विश्लेषण में शामिल करने के लिए एक अच्छा उम्मीदवार हो सकता है।
माइटोकॉन्ड्रिया सेलुलर ऊर्जा चयापचय में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, विशेष रूप से ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण (ओएक्सपीओएस) के माध्यम से एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) का उत्पादन करने के लिए ऑक्सीजन का उपयोग करके। शुक्राणुओं में, विशेष रूप से, एटीपी (ग्लाइकोलाइसिस बनाम ओएक्सपीओएस) का स्रोत विवादित है, और अधिकांश डेटा विवादास्पद बना हुआ है और विभिन्नप्रयोगात्मक दृष्टिकोणों 4,12,13 पर निर्भर करता है। ऑक्सीमेट्री द्वारा श्वसन के माप माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन क्षमता, माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता और सेल14,15,16 के ऊर्जा चयापचय में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। परंपरागत रूप से, इस तकनीक को क्लार्क ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड का उपयोग करके किया गया है- एक उपकरण जिसका उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को मापने के लिए 50 से अधिक वर्षों17,18 से किया गया है। इसके अलावा, शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत का विश्लेषण क्लासिक क्लार्क ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड 19,20,21 का उपयोग करके किया गया है। ऑक्सीग्राफ (ओरोबोरोस) का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वासरोमिति(एचआरआर) शास्त्रीय श्वास-रोमेट्री उपकरणों का उपयोग करने की तुलना में उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है। ऑक्सीग्राफ इंजेक्शन पोर्ट के साथ दो कक्षों से बने होते हैं, और प्रत्येक कक्ष में एक ध्रुवीय ऑक्सीजन सेंसर होता है। इस तकनीक के साथ, ऊतक स्लाइड, कोशिकाओं और पृथक माइटोकॉन्ड्रियल निलंबन का विश्लेषण करना संभव है। नमूना लगातार कक्ष में हिलाया जाता है, और प्रयोग के दौरान, ऑक्सीजन की खपत को मापा जाता है, और विशिष्ट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके ऑक्सीजन दरों की गणना की जाती है। कक्ष कम ऑक्सीजन रिसाव दिखाते हैं, जो पारंपरिक ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड डिवाइस14,23 पर एक फायदा है।
अन्य कोशिकाओं के साथ, शुक्राणुओं के मामले में, एचआरआर उपकरण की संवेदनशीलता पारंपरिक श्वास-मिथुमिति की तुलना में अधिक है, जिसका अर्थ है कि एचआरआर उपकरण का उपयोग सीमित संख्या में बरकरार या परमेबिलाइज्ड शुक्राणु कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। एचआरआर द्वारा शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए दो मुख्य रणनीतियाँ हैं: (ए) बरकरार कोशिकाओं में ऑक्सीजन की खपत को मापना, जिसमें ग्लूकोज जैसे सब्सट्रेट युक्त माध्यम में श्वसन समारोह को पुन: उत्पन्न करना शामिल है, या (बी) प्रत्येक फ़ंक्शन की अलग से निगरानी करने के लिए विशिष्ट सब्सट्रेट्स के अलावा, ओएक्सपीएचओएस कॉम्प्लेक्स में से एक का उपयोग करके परमेबिलाइज्ड कोशिकाओं में ऑक्सीजन की खपत को मापना।
वर्तमान अध्ययन में, हम मानव शुक्राणु कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन निर्धारित करने के लिए एचआरआर के उपयोग का वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
एचआरआर गंभीर रूप से कई चरणों पर निर्भर करता है: (ए) उपकरण रखरखाव, (बी) ऑक्सीजन सेंसर का सटीक अंशांकन, (सी) अनकपलर अनुमापन26, और अंत में, (डी) माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का प्रतिनिधित्व करने वाले सूचकां?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम फर्टिलब एंड्रोलॉजी क्लिनिक, विशेष रूप से जोस मारिया मोंटेस और एंड्रिया टोरेंट्स को धन्यवाद देना चाहते हैं, जिन्होंने हमें दाताओं तक पहुंच की अनुमति दी। फंडिंग: एसी Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021) से अनुदान द्वारा समर्थित है। अतिरिक्त धन प्रोग्रामा डी डेसररोलो डी सिएनसियास बासिकास (पेडेसिबा, उरुग्वे) से प्राप्त किया गया था। पी.आई. और आर.एस. Universidad de la República (I+D, CSIC 2014) द्वारा समर्थित हैं; आई + डी, सीएसआईसी 2016, इनिशिएशियन ए ला इन्वेस्टिगासियोन, सीएसआईसी 2019 और FMV_1_2017_1_136490 एएनआईआई- उरुग्वे)। पी.आई. POS_FMV_2018_1_1007814 और सीएपी-यूडीईएलएआर 2020 द्वारा समर्थित है। आंकड़ों को Biorender.com का उपयोग करके चित्रित किया गया था।
Materials
| Acid free- Bovine serum albumine | Sigma Aldrich | A8806 | |
| Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma Aldrich | A5285 | |
| Animycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
| carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | |
| DatLab sofware version 4,2 | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| L glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L malic acid | Sigma Aldrich | M1000 | |
| Magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Microliter Syringes | Hamilton | 87900 or 80400 | |
| Microscope camera | Basler | acA780-75gc | |
| Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ | Nikon | N/A | |
| Monopotassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | |
| MOPS | Sigma Aldrich | M1254 | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Oxygraph-2 K | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Power O2k-Respirometer | Oroboros Intruments | 10033-01 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Sodium lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | |
| Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research | Microptic | N/A | |
| Sperm Counting Chamber DRM-600 | Millennium Sciences CELL-VU | N/A | |
| Succinate disodium salt | Sigma Aldrich | W327700 |
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