Opprettholde oocytgenomintegritet er nødvendig for å sikre den genetiske troskapen i det resulterende embryoet. Her presenterer vi en nøyaktig protokoll for å oppdage DNA-dobbeltstrengbrudd i pattedyrs kvinnelige kjønnsceller.
Oocytter er blant de største og mest langlivede cellene i kvinnekroppen. De dannes i eggstokkene under embryonisk utvikling og forblir arrestert ved profasen av meiose I. Hviletilstanden kan vare i mange år til oocyttene får et stimulus til å vokse og få kompetanse til å gjenoppta meiose. Denne langvarige tilstanden av arrestasjon gjør dem ekstremt utsatt for akkumulerende DNA-skadelige fornærmelser, som påvirker den genetiske integriteten til de kvinnelige gameter og dermed den genetiske integriteten til det fremtidige embryoet.
Følgelig er utviklingen av en nøyaktig metode for å oppdage DNA-skade, som er det første trinnet for etablering av DNA-skaderesponsmekanismer, av avgjørende betydning. Dette papiret beskriver en felles protokoll for å teste tilstedeværelsen og fremdriften av DNA-skade i profasearresterte oocytter i løpet av en periode på 20 timer. Spesielt dissekerer vi museeggstokkene, henter cumulus-oocytkompleksene (COC), fjerner cumuluscellene fra COC-ene og dyrker oocyttene i Μ2-medium som inneholder 3-isobutyl-1-metylxanthin for å opprettholde arrestasjonstilstanden. Deretter behandles oocyttene med det cytotoksiske, antineoplasmatiske medikamentet, etoposid, for å skape dobbeltstrengbrudd (DSB).
Ved å bruke immunfluorescens og konfokal mikroskopi, oppdager og kvantifiserer vi nivåene av kjerneproteinet γH2AX, som er den fosforylerte formen av histonen H2AX. H2AX blir fosforylert på DSBs lokaliteter etter DNA-skade. Manglende evne til å gjenopprette DNA-integritet etter DNA-skade i oocytter kan føre til infertilitet, fødselsskader og økte frekvenser av spontane aborter. Derfor er forståelsen av DNA-skaderesponsmekanismer og samtidig etableringen av en intakt metode for å studere disse mekanismene avgjørende for reproduktiv biologisk forskning.
Prosessen med meiose i pattedyrs kvinnelige kjønnsceller initieres i eggstokkene før fødselen. Det totale antall oocytter er etablert i eggstokkene primært under embryogenese. Oocytter går inn i meiose og forblir arrestert ved profase I1. Etter utbruddet av puberteten og produksjon og endokrin virkning av follikkelstimulerende hormon (FSH) og luteiniserende hormon (LH), kan oocytter gjenoppta og fullføre meiose2. Hos mennesker kan profasearrest vare i opptil 50 år3. Celledelingene etter inntreden i meiose I er asymmetriske, noe som resulterer i produksjon av en liten polar kropp og en oocyt som beholder sin størrelse. Dermed lagres de fleste cytoplasmatiske komponenter i ooplasma under tidlig embryogenese4. Deretter går oocyttene inn i meiose II, uten å reformere kjernen eller dekondensere kromosomene, og forblir arrestert i metafase II til befruktning5.
En unik egenskap som skiller oocytter fra somatiske celler er tilstanden av arrestasjon i profase I, når oocytten har en intakt kjerne (germinal vesikkel [GV] arrest), referert til som GV stadium6. Basert på kromatinorganisasjonen klassifiseres GV-stadium oocytter i to kategorier: ikke-omgitt nukleolus (NSN) og omgitt nukleolus (SN) 7,8. I NSN GV-stadium oocytter sprer kromatinet seg gjennom hele kjerneområdet, og transkripsjon er aktiv, mens kromatinet i SN-oocytter danner en kompakt ring som omgir nukleolus, og transkripsjonen er stille9. Begge typer GV-stadium oocytter viser meiotisk kompetanse; de går inn i meiose i samme hastighet, men NSN-oocyttene presenterer lav utviklingskapasitet og kan ikke utvikle seg utover tocellestadiet embryo10.
Den langvarige tilstanden av profase I-arrestasjon øker forekomsten av DNA-skadeakkumulering11. Derfor er DNA-skaderesponsmekanismer i oocytter avgjørende for å tillate produksjon av gameter med genetisk integritet og for å sikre at det resulterende embryoet har et fysiologisk kromosominnhold.
Et sentralt aspekt ved DNA-skaderesponsen er DNA-reparasjon. Hovedveiene for DSB-reparasjon i eukaryote celler inkluderer ikke-homolog endesammenføyning (NHEJ), homolog rekombinasjon (HR) og alternativ NHEJ12,13,14,15. NHEJ er en raskere, men mer feilutsatt mekanisme, mens HR krever mer tid for å fullføres, men har høy troskap16.
Det er ikke nok kunnskap om mekanismene som oocytter bruker for reparasjon av DNA-skader. Studier har vist at DNA-skade indusert i fullvoksne pattedyroocytter ved bruk av genotoksiske midler, som etoposid, doksorubicin eller UVB eller ioniserende stråling, ikke påvirker tidspunktet og utgangshastigheten fra profase I arrest17. Oocytter kan gjennomgå GV-nedbrytning (GVBD) selv i nærvær av forhøyede nivåer av skade. Denne skaden kan bestemmes ved observasjon av γH2AX. Denne fosforylerte formen av H2AX (γΗ2ΑΧ) er en DSB-markør, som ligger på bruddstedet og fungerer som et stillas for å hjelpe til med å reparere faktorer og proteiner for å akkumulere i ødelagte ender18.
Fraværet av cellesyklusstans etter DNA-skade skyldes et utilstrekkelig DNA-skadekontrollpunkt som gjør at oocytter med ureparert DNA kan gå inn i meiose igjen. Etter høye nivåer av DNA-skade kan et kontrollpunkt opprettholde profasearrest gjennom aktivering av en ATM / Chk1-avhengig vei. Den begrensede sjekkpunktresponsen til DSB skyldes begrenset aktivering av minibank17,19. I M-fasen av meiose I har forskning vist at DNA-skade kan aktivere et spindelmonteringskontrollpunkt (SAC) -indusert meiose I-kontrollpunkt, som forhindrer aktivering av E3 ubiquitin ligase anafasefremmende kompleks / syklosom (APC / C) og derfor M-fase utgang. Videre overvinner ablasjonen av SAC-proteiner tilstanden av M-fasearrest, og understreker dermed betydningen av SAC i etableringen av meiosen I chekpoint20.
Som tidligere forskning tydelig viser, kan ikke DSB indusere et robust profasekontrollpunkt i museoocytter. Hvis slike skader ikke repareres, kan det føre til at embryoer bærer kromosomale abnormiteter. Derfor er det viktig å studere DNA-skaderesponsen på forskjellige stadier av kvinnelig gametogenese for bedre å forstå de unike veiene som oocytter bruker for å takle potensielle genetiske fornærmelser.
Ved å bruke metoden beskrevet her, påviste vi DSB i pattedyrs oocytter. Denne metoden tillater deteksjon og studier av DNA-reparasjonsprosessen i oocytter. Den samme protokollen kan også brukes til å analysere andre proteiner som deltar i fysiologiske prosesser i pattedyrs oocytter. Det er viktig å studere hvordan oocytter reagerer på potensiell DNA-skade for bedre å forstå årsaken til kvinnelig subfertilitet hos mennesker.
Å studere DNA-skaderesponsen i pattedyrs oocytter kan være utfordrende på grunn av følsomheten til oocytter. Oocythåndtering krever spesifikke temperaturer og CO 2 og O2 konsentrasjoner. Samtidig må oocyttene beskyttes mot lys. Αll-håndtering bør gjøres ved å bruke glasspipetter som ikke er smale, da dette kan være skadelig for oocytter, men heller ikke toο bredt, da dette kan føre til fortynning av mediet og dermed påvirke fikseringsprosedyren negativt. I hvert fikseringstrinn brukes flere dråper buffere for å minimere fortynningseffekten. En alternativ måte å observere DSB på er Comet-analysen24. Selv om denne teknikken er mer følsom, er den mer komplisert. Samtidig, ved å bruke Comet-analysen, er det ikke mulig å oppdage det nøyaktige DNA-området der skaden oppstår, og i celler med rikelig RNA-molekyler, som GV-stadium oocytter25, kan bakgrunnen økes, noe som fører til et falskt DNA-skadesignal26.
Ved å bruke immunfluorescensprotokollen beskrevet her, kan vi oppdage DSB med nøyaktighet og estimere reparasjonsfremdriften i GV-stadium oocytter, som indikert ved reduksjonen i γH2AX fluorescens over tid. Likevel er en begrensning av denne metoden at visse antistoffer kan presentere uspesifikk fordeling gjennom ooplasma, og dermed føre til bilder med høy bakgrunnsfluorescens. PFA-Tx-100-bufferen brukes i stedet for sekvensiell PFA og Tx-100, da vi har observert at den forbedrer fikseringsprosessen ved å tillate deteksjon av mindre bakgrunn og ikke-spesifikk fluorescens. En annen begrensning ved bruk av γH2AX for DSB-deteksjon er at skade ikke kan estimeres etter GVBD på grunn av spontan fosforylering av γH2AX i meiose23.
I denne immunfluorescensprotokollen forblir oocyttene i en væskebuffer og kan ikke lagres i lysbilder. Dette faktum gjør det vanskelig å bevare de faste cellene i flere dager etter tilsetning av sekundært antistoff. For å oppnå bilder av god kvalitet og ikke miste signalet, er det å foretrekke å utføre avbildningen innen få timer etter tilsetning av det sekundære antistoffet. Det skal også bemerkes at skanningen av kjernene gjennom Z-aksen kan gjøre signalet svakere på grunn av overeksponering. Av den grunn er det å foretrekke å senke lasereffekten og øke hastigheten på skanningen.
Til slutt er en annen begrensning av immunfluorescensprotokollen at den bare kan brukes til faste / ikke-levende celler. Derfor kan vi bare estimere tilstedeværelsen og fraværet av faktorer på bestemte tidspunkter uten å vite om det er noen svingninger i konsentrasjonen eller endringer i deres oppførsel gjennom tiden. Dette problemet kan løses ved å bruke levende cellebilder og fluorescerende merkede markører.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner støtte til dette arbeidet fra prosjektet “Etablering av ‘kapasitetsbyggende’ infrastrukturer i biomedisinsk forskning (BIOMED-20)” (MIS 5047236), som er implementert under handlingen “Forsterkning av forsknings- og innovasjonsinfrastrukturen”, finansiert av det operative programmet “Competitiveness, Entrepreneurship and Innovation” (NSRF 2014-2020), og delfinansiert av Hellas og EU (European Regional Development Fund).
3 mL Pasteur pipettes in LDPE, graduated | APTACA | 1502 | |
10 cc syringes | SoftCare | 114.104.21 | |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit Secondary Ab | Biotium | 20012 | |
Anti-phospho-H2A.X (Ser139) | Merck Millipore | 07-164 | |
ARE Heating Magnetic Stirrer | VELP Scientifica | F20500162 | |
BD FALCON 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | BD Biosciences | 352054 | |
BD Microlance 3 Needles 27 G – 0.40 x 13 mm | Becton Dickinson | 300635 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
DMSO Anhydrous | Biotium | 90082 | |
DRAQ7 DNA dye | BioStatus | DR71000 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
EMSURE MgCl2. 6H2O | Merck Millipore | 1058330250 | |
Etoposide | CHEMIPHARM | L01CB01 | |
FALCON 14 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | Corning Science | 532057 | |
FALCON Tissue Culture Dishes, Easy-Grip, 35 x 10 mm Style | Corning Science | 353001 | |
Glass Bottom Culture Dishes (35 mm Petri dish/ 14 mm Microwell, No. 0 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H6147-25G | |
HERACELL 150i CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 50116048 | |
IBMX powder | Sigma-Aldrich | I5879-100MG | |
Leica M125 Stereo Microscope | Leica Microsystems | ||
M16 Medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
NaN3 | Honeywell | 13412H | |
NaOH | Merck Millipore | 1064981000 | |
Nikon AX ECLIPSE Ti2 Confocal Microscope | Nikon Corporation | ||
Nikon SMZ800N Stereo Microscope | Nikon Corporation | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Pasteur pippettes, glass, long form 230 mm | DURAN WHEATON KIMBLE | 357335 | |
pH/ORP meter | Hanna Instruments Ltd | HI2211 | |
Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | |
PMSG Protein Lyophilised | Genway Biotech (now AVIVA Systems Biology) | GWB-2AE30A (now OPPA01037) | |
QBD4 Dry block heater | Grant Instruments (Cambridge) Ltd | A25218 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Whatman Puradisc 25 mm 0.2 μm filters | GE Healthcare | 6780-2502 |