Stabilisiertes Fenster für die intravitale Bildgebung der murinen Bauchspeicheldrüse

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll für die chirurgische Implantation eines stabilisierten optischen Bleibefensters für die subzellulär aufgelöste Bildgebung der murinen Bauchspeicheldrüse, das serielle und longitudinale Studien der gesunden und erkrankten Bauchspeicheldrüse ermöglicht.

Abstract

Die Physiologie und Pathophysiologie der Bauchspeicheldrüse ist komplex. Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse, wie Pankreatitis und Pankreas-Adenokarzinom (PDAC), weisen eine hohe Morbidität und Mortalität auf. Die Intravital-Bildgebung (IVI) ist eine leistungsstarke Technik, die die hochauflösende Bildgebung von Geweben sowohl im gesunden als auch im erkrankten Zustand ermöglicht und eine Echtzeitbeobachtung der Zelldynamik ermöglicht. Die IVI der murinen Bauchspeicheldrüse stellt aufgrund der tiefen viszeralen und nachgiebigen Natur des Organs eine große Herausforderung dar, was es sehr anfällig für Schäden und Bewegungsartefakte macht.

Hier wird der Prozess der Implantation des Stabilisierten Window für die Intravitale Bildgebung des murinen P-Ankreas (SWIP) beschrieben. Das SWIP ermöglicht die IVI der murinen Bauchspeicheldrüse in normalen gesunden Zuständen, während der Transformation von der gesunden Bauchspeicheldrüse zu einer akuten Pankreatitis, die durch Cerulein induziert wird, und in malignen Zuständen wie Pankreastumoren. In Verbindung mit genetisch markierten Zellen oder der Verabreichung von Fluoreszenzfarbstoffen ermöglicht das SWIP die Messung der einzelligen und subzellulären Dynamik (einschließlich Einzelzell- und kollektiver Migration) sowie die serielle Bildgebung derselben interessierenden Region über mehrere Tage.

Die Fähigkeit, die Migration von Tumorzellen zu erfassen, ist von besonderer Bedeutung, da die Hauptursache für die krebsbedingte Mortalität bei PDAC die überwältigende Metastasierungslast ist. Das Verständnis der physiologischen Dynamik der Metastasierung bei PDAC ist ein kritischer ungedeckter Bedarf und entscheidend für die Verbesserung der Patientenprognose. Insgesamt bietet das SWIP eine verbesserte Bildgebungsstabilität und erweitert die Anwendung von IVI bei gesunden Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse und der bösartigen Bauchspeicheldrüse.

Introduction

Gutartige und bösartige Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse sind potenziell lebensbedrohlich und weisen erhebliche Lücken im Verständnis ihrer Pathophysiologie auf. Pankreatitis – eine Entzündung der Bauchspeicheldrüse – ist die dritthäufigste Ursache für Krankenhauseinweisungen und Wiedereinweisungen im Zusammenhang mit Magen-Darm-Erkrankungen in den USA und ist mit erheblicher Morbidität, Mortalität und sozioökonomischer Belastung verbunden¹. Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC), das als dritthäufigste krebsbedingte Todesursache eingestuft wird 2, ist für die meisten Pankreasmalignome^{verantwortlich} 3 und weist eine schlechte 5-Jahres-Überlebensrate von nur 11 %² auf2. Die Hauptursache für krebsbedingte Mortalität bei PDAC ist eine überwältigende metastasierende Belastung. Leider weisen die meisten Patienten eine metastasierende Erkrankung auf. Daher ist das Verständnis der Dynamik der Metastasierung bei PDAC ein kritischer ungedeckter Bedarf auf dem Gebiet der Krebsforschung.

Die Mechanismen, die der Entzündung und der Metastasierung der Bauchspeicheldrüse zugrunde liegen, sind nur unzureichend verstanden. Ein wesentlicher Faktor für diese Wissenslücke ist die Unfähigkeit, die zelluläre Dynamik der Bauchspeicheldrüse in vivo zu beobachten. Die direkte Beobachtung dieser zellulären Dynamik verspricht, wichtige Ziele zu enthüllen, um die Diagnose und Behandlung von Menschen mit Bauchspeicheldrüsenerkrankungen zu verbessern und zu verbessern.

Intravital Imaging (IVI) ist eine Mikroskopietechnik, die es Forschern ermöglicht, biologische Prozesse in lebenden Tieren in Echtzeit zu visualisieren und zu untersuchen. IVI ermöglicht eine hochauflösende, direkte Visualisierung der intrazellulären und mikroumgebungsbezogenen Dynamik in vivo und in der nativen Umgebung des jeweiligen biologischen Prozesses. Daher ermöglicht die IVI die In-vivo-Beobachtung gesunder und pathologischer Prozesse.

Moderne Ganzkörper-Bildgebungsverfahren wie MRT, PET und CT bieten hervorragende Ansichten ganzer Organe und können Pathologien aufdecken, noch bevor klinische Symptome auftreten⁴. Sie sind jedoch nicht in der Lage, eine Einzelzellauflösung zu erreichen oder die frühesten Stadien der Krankheit – Pankreatitis oder Malignität – aufzudecken.

Frühere Forschungen haben die IVI mit Einzelzellauflösung verwendet, um gutartige und bösartige Erkrankungen der Haut^5,6, der Brust⁷, der Lunge⁸, der Leber⁹, des Gehirns¹⁰ und der Bauchspeicheldrüsentumoren 11 zu beobachten^, was zu Einblicken in die Mechanismen des Krankheitsverlaufs führte¹². Die murine Bauchspeicheldrüse stellt jedoch erhebliche Hindernisse für das Erreichen einer Einzelzellauflösung mit IVI dar, vor allem aufgrund ihrer tiefen viszeralen Lage und ihrer hohen Compliance. Darüber hinaus ist es ein verzweigtes, diffus verteiltes Organ innerhalb des Mesenteriums, das mit der Milz, dem Dünndarm und dem Magen verbunden ist, was den Zugang erschwert. Das Gewebe reagiert auch sehr empfindlich auf Bewegungen, die durch angrenzende Peristaltik und Atmung verursacht werden. Die Minimierung der Bewegung der Bauchspeicheldrüse ist für die Einzelzellauflösung von entscheidender Bedeutung, da Bewegungsartefakte von nur wenigen Mikrometern die Bilder verwischen und verzerren können, was es unmöglich macht, die Dynamik einzelner Zellen zu verfolgen¹³.

Um eine IVI durchführen zu können, muss ein abdominelles Bildgebungsfenster (AIW) chirurgisch implantiert werden ^9,11. Um die AIW operativ zu implantieren, wird ein Fensterrahmen aus Metall in die Bauchdecke eingenäht. Anschließend wird das gewünschte Organ mit Cyanacrylat-Kleber am Rahmen befestigt. Während dies für einige starre innere Organe (z. B. Leber, Milz, starre Tumore) ausreichend ist, werden Versuche, die gesunde murine Bauchspeicheldrüse abzubilden, durch suboptimale laterale und axiale Stabilität aufgrund der nachgiebigen Textur des Gewebes und der komplexen Architektur beeinträchtigt¹⁴. Um dieser Einschränkung zu begegnen, entwickelten Park et ^al.14 ein Bildgebungsfenster, das speziell für die gesunde Bauchspeicheldrüse entwickelt wurde. Dieses Pankreas-Bildgebungsfenster (PIW) minimiert den Einfluss der Darmbewegung und der Atmung, indem es ein horizontales Metallregal in den Fensterrahmen, direkt unter dem Deckglas, integriert, das Gewebe stabilisiert und seinen Kontakt mit dem Deckglas aufrechterhält. Während das PIW eine erhöhte laterale Stabilität bietet, haben wir festgestellt, dass dieses Fenster immer noch eine axiale Drift aufweist und zusätzlich die Bildgebung großer solider Tumore aufgrund des schmalen Spalts zwischen dem Metallregal und dem Deckglas¹⁵ verhindert.

Um diesen Einschränkungen zu begegnen, haben wir das Stabilisierte Window für die intravitaleBildgebung des murinen P-Ankras (SWIP) entwickelt, ein implantierbares Bildgebungsfenster, das in der Lage ist, eine stabile Langzeitbildgebung sowohl der gesunden als auch der erkrankten Bauchspeicheldrüse zu erreichen (Abbildung 1)¹⁵. Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll für den chirurgischen Eingriff zur Implantation des SWIP zur Verfügung. Obwohl das primäre Ziel darin bestand, die dynamischen Mechanismen der Metastasierung zu untersuchen, kann diese Methode auch verwendet werden, um verschiedene Aspekte der Biologie und Pathologie der Bauchspeicheldrüse zu untersuchen.

Protocol

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften für die Verwendung von Wirbeltieren durchgeführt, einschließlich der vorherigen Genehmigung durch das Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Passivierung von Fenstern HINWEIS: Die Passivierung von Edelstahl reinigt das Metall von Verunreinigungen und erzeugt eine dünne Oxidschicht, di…

Representative Results

Abbildung 1, adaptiert von Du et al.15, zeigt Standbilder aus einem Zeitraffer-IVI-Film der murinen Bauchspeicheldrüse. Innerhalb der anfänglichen Eingewöhnungsphase (erste Stunde der Bildgebung, Abbildung 1A) kann eine gewisse Gewebebewegung beobachtet werden. Bei fortgesetzter Bildgebung nach dieser Eingewöhnungsphase (>75 min) beobachteten wir jedoch eine Zunahme der lateralen und axialen Stabilität (Abbildung…

Discussion

Das hier beschriebene SWIP-Protokoll bietet eine verbesserte Methode zur Stabilisierung des Bauchspeicheldrüsengewebes unter Verwendung einer Kreuzstichkorbtechnik. Frühe abdominale Bildgebungsfenster (AIWs) ermöglichten die intravitale Bildgebung (IVI) der inneren Organe des Abdomens, schränkten aber die Bewegung von Weichteilen wie der Bauchspeicheldrüse nicht ausreichend ein. Als Reaktion darauf entwickelten Park et al. ein Pankreas-Bildgebungsfenster (PIW), das eine horizontale Metallablage enthält und eine ver…

Materials

1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate – Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate – Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].