חלון מיוצב להדמיה תוך חיונית של הלבלב המוריני
Summary
אנו מציגים פרוטוקול להשתלה כירורגית של חלון אופטי מיוצב להדמיה ברזולוציה תת-תאית של הלבלב המורין, המאפשר מחקרים סדרתיים ואורכיים של הלבלב הבריא והחולה.
Abstract
הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של הלבלב מורכבות. מחלות הלבלב, כגון דלקת הלבלב ואדנוקרצינומה של הלבלב (PDAC) הן בעלות תחלואה ותמותה גבוהות. הדמיה תוך-חיונית (IVI) היא טכניקה רבת עוצמה המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של רקמות הן במצב בריא והן במצב חולה, ומאפשרת תצפית בזמן אמת על הדינמיקה של התא. IVI של הלבלב המורין מציב אתגרים משמעותיים בשל האופי הקרבי העמוק והתואם של האיבר, מה שהופך אותו למועד מאוד לנזק ותנועה.
מתואר כאן תהליך ההשתלה של Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP). SWIP מאפשר IVI של הלבלב murine במצבים בריאים נורמליים, במהלך המעבר מהלבלב הבריא לדלקת לבלב חריפה הנגרמת על ידי cerulein, ובמצבים ממאירים כגון גידולים בלבלב. בשילוב עם תאים המסומנים גנטית או מתן צבעים פלואורסצנטיים, SWIP מאפשר מדידה של דינמיקה של תא בודד ותת-תאי (כולל הגירה חד-תאית וקולקטיבית) כמו גם הדמיה סדרתית של אותו אזור עניין במשך מספר ימים.
היכולת ללכוד נדידת תאי גידול היא בעלת חשיבות מיוחדת מכיוון שהגורם העיקרי לתמותה הקשורה לסרטן ב- PDAC הוא הנטל הגרורתי העצום. הבנת הדינמיקה הפיזיולוגית של גרורות ב- PDAC היא צורך קריטי שלא נענה וחיוני לשיפור הפרוגנוזה של המטופל. בסך הכל, SWIP מספק יציבות הדמיה משופרת ומרחיב את היישום של IVI בלבלב בריא ומחלות לבלב ממאירות.
Introduction
מחלות לבלב שפירות וממאירות עלולות לסכן חיים, עם פערים ניכרים בהבנת הפתופיזיולוגיה שלהן. דלקת הלבלב – דלקת בלבלב – היא הגורם השלישי בחשיבותו לאשפוזים ואשפוזים חוזרים הקשורים למחלות במערכת העיכול בארה”ב והיא קשורה לתחלואה משמעותית, תמותה ונטל סוציו-אקונומי1. מדורג כגורם השלישי המוביל למוות הקשור לסרטן2, אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) מהווה את רוב הממאירויות בלבלב3 ומבשר על שיעור הישרדות גרוע של 5 שנים של 11% בלבד 2. הגורם המוביל לתמותה מסרטן ב-PDAC הוא עומס גרורתי עצום. למרבה הצער, רוב החולים נוכחים עם מחלה גרורתית. לכן, הבנת הדינמיקה של גרורות ב-PDAC היא צורך קריטי שלא נענה בתחום חקר הסרטן.
המנגנונים העומדים בבסיס הדלקת והמפל הגרורתי של הלבלב אינם מובנים היטב. תורם עיקרי לפער הידע הזה הוא חוסר היכולת לצפות בדינמיקה התאית של הלבלב in vivo. התבוננות ישירה בדינמיקה התאית הזו מבטיחה לחשוף מטרות קריטיות כדי למנף ולשפר את האבחון והטיפול בחולי מחלות לבלב.
הדמיה תוך-חיונית (IVI) היא טכניקת מיקרוסקופיה המאפשרת לחוקרים לדמיין ולחקור תהליכים ביולוגיים בבעלי חיים בזמן אמת. IVI מאפשר הדמיה ישירה ברזולוציה גבוהה של דינמיקה תוך-תאית ומיקרו-סביבתית in vivo ובתוך הסביבה הטבעית של התהליך הביולוגי המדובר. לכן, IVI מאפשר התבוננות in vivo של תהליכים בריאים ופתולוגיים.
שיטות הדמיה עכשוויות של כל הגוף כגון MRI, PET ו- CT מציעות תצוגות מצוינות של איברים שלמים ויכולות לחשוף פתולוגיות, עוד לפני הופעת הסימפטומים הקליניים4. הם אינם מסוגלים, עם זאת, להשיג רזולוציה של תא בודד או לחשוף את השלבים המוקדמים ביותר של מחלה – לבלב או ממאירות.
מחקרים קודמים השתמשו ב- IVI ברזולוציה של תא יחיד כדי לצפות במחלות שפירות וממאירות של עור5,6, שד7, ריאות8, כבד9, מוח 10 וגידולי לבלב 11, מה שהוביל לתובנות לגבי מנגנונים של התקדמות המחלה 12. עם זאת, הלבלב המוריני מציב מכשולים משמעותיים להשגת רזולוציה של תא בודד באמצעות IVI, בעיקר בשל מיקומו הקרבי העמוק והתאימות הגבוהה שלו. יתר על כן, זהו איבר מסועף ומפוזר בתוך המזנטריה המתחבר לטחול, למעי הדק ולקיבה, מה שהופך אותו למאתגר לגישה. הרקמה גם רגישה מאוד לתנועה הנגרמת על ידי פריסטלטיקה סמוכה ונשימה. מזעור התנועה של הלבלב חיוני למיקרוסקופיה ברזולוציה של תא יחיד, מכיוון שתוצרי תנועה של אפילו מיקרונים בודדים יכולים לטשטש ולעוות תמונות, מה שהופך את המעקב אחר הדינמיקה של תאים בודדים לבלתי אפשרי13.
כדי לבצע IVI, חלון הדמיה בטני (AIW) חייב להיות מושתל בניתוח 9,11. כדי להשתיל את AIW בניתוח, מסגרת חלון מתכת נתפרת לתוך דופן הבטן. לאחר מכן, האיבר המעניין מחובר למסגרת באמצעות דבק ציאנואקרילט. בעוד שזה מספיק עבור כמה איברים פנימיים נוקשים (למשל, כבד, טחול, גידולים קשיחים), ניסיונות הדמיה של הלבלב הבריא של מורין נפגעים על ידי יציבות צידית וצירית לא אופטימלית בשל מרקם תואם הרקמה וארכיטקטורה מורכבת14. כדי להתמודד עם מגבלה זו, Park et al.14 פיתחו חלון הדמיה שתוכנן במיוחד עבור הלבלב הבריא. חלון הדמיה זה של הלבלב (PIW) ממזער את השפעת תנועת המעי והנשימה על ידי שילוב מדף מתכת אופקי בתוך מסגרת החלון, ממש מתחת לכיסוי הכיסוי, מייצב את הרקמה ושומר על המגע שלה עם זכוכית הכיסוי. בעוד שה-PIW מציע יציבות צידית מוגברת, מצאנו כי חלון זה עדיין מדגים סחף צירי ובנוסף מונע הדמיה של גידולים מוצקים גדולים בשל המרווח הצר בין מדף המתכת לכיסוי15.
כדי להתמודד עם המגבלות האלה, פיתחנו את ה-Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP), חלון הדמיה מושתל המסוגל להשיג הדמיה יציבה לטווח ארוך של הלבלב הבריא והחולה כאחד (איור 1)15. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מקיף עבור ההליך הכירורגי המשמש להשתלת SWIP. למרות שהמטרה העיקרית הייתה לחקור את המנגנונים הדינמיים המעורבים בגרורות, ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לחקור היבטים שונים של ביולוגיה ופתולוגיה של הלבלב.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול SWIP המתואר כאן מספק שיטה משופרת לייצוב רקמת הלבלב על ידי שימוש בטכניקת סל תפר צולב. חלונות דימות בטן מוקדמים (AIWs) אפשרו הדמיה תוך חיונית (IVI) של איברים פנימיים של הבטן, אך לא הגבילו במידה מספקת את תנועת הרקמות הרכות כגון הלבלב. בתגובה, פארק ועמיתיו פיתחו חלון הדמיה לבלב (PIW) המשלב מדף מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
קרן הצדקה ע”ש אוולין ליפר, מרכז גרוס-ליפר לביופוטוניקה, תוכנית הדימות המשולבת לחקר הסרטן, מלגת T-32 של NIH (CA200561) ומענק של תוכנית מחקר סרטן הלבלב של משרד ההגנה (PCARP) PA210223P1.
Materials
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | NA | Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Passivation reagent |
| 5 mm cover glass | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | Round Glass Coverslips |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | Passivation reagent |
| 28G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | Syringe for cell injection |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic |
| Bench Mount Heat Lamp | McMaster-Carr | 3349K51 | Heat lamp |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Covetrus North America | 059122 | Buprenorphine Analgesia |
| Castroviejo Curved Scissors | World Precision Instruments | WP2220 | Scissor for cutting tissue |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J Mouse |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | Compressed air for drying tissue |
| Cyano acrylate – Gel Superglue | Staples | 234790-6 | Skin Glue |
| Cyano acrylate – Liquid Superglue | Staples | LOC1647358 | Coverslip Glue |
| DPBS 1x | Corning | 21-031-CV | DPBS for cerulein/cell injections |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Graefe Micro Dissecting Forceps |
| Imaging microscope | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Imaging software | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | Isoflurane Anesthesia |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Kim Wipes |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | Laboratory Tape |
| Mouse Dissecting Kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Surgical Instruments |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific Corpo | MSTAT Sensor-MSE | Pulse Oximeter |
| Mouse Surgisuite | Kent Scientific | SURGI-M04 | Heated platform |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory Lotion |
| Oxygen | TechAir | OX TM | Oxygen |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0 | VWR | 95056-872 | Silk Suture |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Life Technologies | 10010-023 | PBS |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Heated Platform Controller |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | Cotton Swabs |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL | Denville Scientific Inc. | P1125 | 100 µL Pipet Tips |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | Vascular Label |
| Window-fixturing plate | NA | NA | Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8]. |
| Window Frame | NA | NA | The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8]. |
References
- Peery, A. F., et al. Burden and cost of gastrointestinal, liver, and pancreatic diseases in the United States: Update 2021. Gastroenterology. 162 (2), 621-644 (2022).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 73 (1), 17-48 (2023).
- Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338 (2017).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry A. 97 (5), 448-457 (2020).
- Peters, N. C., et al. In vivo imaging reveals an essential role for neutrophils in leishmaniasis transmitted by sand flies. Science. 321 (5891), 970-974 (2008).
- Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1147-1154 (2008).
- Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Park, K., You, J., Du, C., Pan, Y. Cranial window implantation on mouse cortex to study microvascular change induced by cocaine. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5 (1), 97-107 (2015).
- Beerling, E., Oosterom, I., Voest, E., Lolkema, M., van Rheenen, J. Intravital characterization of tumor cell migration in pancreatic cancer. Intravital. 5 (3), e1261773 (2016).
- Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews: Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
- Entenberg, D., et al. time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
- Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
- Du, W., et al. SWIP-a stabilized window for intravital imaging of the murine pancreas. Open Biology Journal. 12 (6), 210273 (2022).
- DeBold, T. A. M., James, W. . How To Passivate Stainless Steel Parts. , (2003).
- Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
- Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), pdb prot5563 (2011).
- Moral, J. A., et al. ILC2s amplify PD-1 blockade by activating tissue-specific cancer immunity. Nature. 579 (7797), 130-135 (2020).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), dmm034793 (2018).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042 (2016).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 19, 19.7.1-19.7.19 (2013).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments. (116), 54603 (2016).
- Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments. (131), 55115 (2018).
- Gorelick, F. S., Lerch, M. M. Do animal models of acute pancreatitis reproduce human disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (2), 251-262 (2017).
- Dolai, S., et al. Depletion of the membrane-fusion regulator Munc18c attenuates caerulein hyperstimulation-induced pancreatitis. Journal of Biological Chemistry. 293 (7), 2510-2522 (2018).
- Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5 Pt 1), 1192-1204 (1985).
- Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
- Shanja-Grabarz, X., Coste, A., Entenberg, D., Di Cristofano, A. Real-time, high-resolution imaging of tumor cells in genetically engineered and orthotopic models of thyroid cancer. Endocrine-Related Cancer. 27 (10), 529-539 (2020).
