マウス膵臓の生体内イメージングのための安定化ウィンドウ
Summary
マウス膵臓の細胞内分解能イメージングのための安定化された留置光学窓の外科的移植のプロトコルを提示し、健康な膵臓と病気の膵臓の連続的および縦断的研究を可能にします。
Abstract
膵臓の生理学と病態生理学は複雑です。膵炎や膵臓腺癌(PDAC)などの膵臓の疾患は、罹患率と死亡率が高い。生体内イメージング(IVI)は、健康な状態と病気の状態の両方の組織の高解像度イメージングを可能にする強力な技術であり、細胞動態のリアルタイム観察を可能にします。マウス膵臓のIVIは、臓器の深い内臓とコンプライアンスの性質により、損傷や運動アーチファクトが非常に起こりやすいため、重大な課題を提示します。
ここで説明するのは、マウスPancreas(SWIP)のIntravitalイメージングのためのStabilized Wインドウの移植プロセスです。SWIPは、正常な健康な状態、健康な膵臓からセルレインによって誘発される急性膵炎への転換中、および膵臓腫瘍などの悪性状態におけるマウス膵臓のIVIを可能にします。SWIPは、遺伝子標識細胞または蛍光色素の投与と組み合わせて、単一細胞および細胞内動態(単一細胞および集団移動を含む)の測定、および数日間にわたる同じ関心領域の連続イメージングを可能にします。
PDACにおけるがん関連死亡率の主な原因は圧倒的な転移性負担であるため、腫瘍細胞の移動を捕捉する能力は特に重要です。PDACにおける転移の生理学的動態を理解することは、満たされていない重要なニーズであり、患者の予後を改善するために重要です。全体として、SWIPはイメージングの安定性を向上させ、健康な膵臓および悪性膵臓疾患におけるIVIの適用を拡大します。
Introduction
良性および悪性の膵臓疾患は生命を脅かす可能性があり、その病態生理学の理解にはかなりのギャップがあります。膵炎(膵臓の炎症)は、米国における消化器疾患関連の入院および再入院の第3大原因であり、かなりの罹患率、死亡率、および社会経済的負担に関連しています1。膵管腺がん(PDAC)は、がん関連死因の第3位2にランクされており、膵臓悪性腫瘍の大半を占めており3 、5年生存率はわずか11%2と低いことを示しています。PDACにおけるがん関連死亡率の主な原因は、圧倒的な転移性負担です。残念ながら、ほとんどの患者は転移性疾患を呈します。したがって、PDACにおける転移の動態を理解することは、がん研究の分野における重要なアンメットニーズです。
炎症と膵臓の転移カスケードを支えるメカニズムは十分に理解されていません。この知識のギャップの主な原因は、 in vivoで膵臓の細胞動態を観察できないことです。これらの細胞動態を直接観察することで、膵臓疾患患者の診断と治療を活用し、改善するための重要な標的を明らかにすることが期待されます。
生体内イメージング(IVI)は、研究者が生きている動物の生物学的プロセスをリアルタイムで視覚化して研究できるようにする顕微鏡技術です。IVIは、生体内および生体プロセスの天然環境内の細胞 内 および微小環境のダイナミクスを高解像度で直接可視化することができます。したがって、IVIは、健康および病理学的プロセスの in vivo 観察を可能にします。
MRI、PET、CTなどの現代の全身画像モダリティは、臓器全体の優れたビューを提供し、臨床症状の発症前でも病状を明らかにすることができます4。しかし、単一細胞の分解能を達成したり、膵炎や悪性腫瘍などの疾患の初期段階を明らかにしたりすることはできません。
これまでの研究では、皮膚5,6、乳房7、肺8、肝臓9、脳10、膵臓腫瘍11の良性および悪性疾患を単細胞分解能IVIで観察し、疾患の進行メカニズムに関する洞察を得ています12。しかし、マウスの膵臓は、主に内臓の奥深くに位置し、コンプライアンスが高いため、IVIを使用して単一細胞の解像度を達成する上で大きな障害となっています。さらに、腸間膜内の枝分かれしたびまん性に分布する器官であり、脾臓、小腸、胃に接続しているため、アクセスが困難です。組織はまた、隣接する蠕動運動と呼吸によって引き起こされる動きに対して非常に敏感です。膵臓の動きを最小限に抑えることは、数ミクロンの動きでさえ画像をぼやけさせ、歪ませ、個々の細胞の動態を追跡することを不可能にするため、単一細胞分解能顕微鏡検査に不可欠です13。
IVIを実施するには、腹部イメージングウィンドウ(AIW)を外科的に埋め込む必要があります9,11。AIWを外科的に移植するには、金属製の窓枠を腹壁に縫合します。その後、シアノアクリレート接着剤を使用して目的の臓器をフレームに取り付けます。これは一部の硬い内臓(肝臓、脾臓、硬い腫瘍など)には十分であるが、健康なマウスの膵臓を画像化する試みは、組織の準拠したテクスチャと複雑な構造のために最適ではない側方向および軸方向の安定性によって損なわれる14。この制限に対処するために、Parkらは、健康な膵臓用に特別に設計されたイメージングウィンドウを開発しました14。この膵臓イメージングウィンドウ(PIW)は、カバーガラスのすぐ下の窓枠内に水平な金属製の棚を組み込み、組織を安定させ、カバーガラスとの接触を維持することで、腸の動きと呼吸の影響を最小限に抑えます。PIWは横方向の安定性を高めているが、この窓は依然として軸方向のドリフトを示し、さらに金属製の棚とカバーガラス15の間の狭い隙間のために大きな固形腫瘍のイメージングを妨げることがわかった。
これらの制限に対処するために、私たちは、健康な膵臓と病気の膵臓の両方の安定した長期イメージングを達成できる埋め込み型イメージングウィンドウである、マウスPancreas(SWIP)のIntravitalイメージング用のStabilized Windowを開発しました(図1)15。ここでは、SWIPを埋め込むために使用される外科的処置の包括的なプロトコルを提供します。主な目的は転移に関与する動的メカニズムを研究することでしたが、この方法は、膵臓の生物学と病理学のさまざまな側面を探求するためにも利用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するSWIPプロトコルは、クロスステッチバスケット技術を利用して、膵臓組織を安定化するための改良された方法を提供します。初期の腹部画像窓(AIW)は、腹部の内臓の生体内画像(IVI)を可能にしたが、膵臓などの軟部組織の動きを適切に制限していなかった。これに対応して、Parkらは、水平の金属棚を組み込んで、ガラスカバーガラスとの接触を維持しながら膵臓組織の安定性を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Evelyn Lipper Charitable Foundation、Gruss-Lipper Biophotonics Center、Integrated Imaging Program for Cancer Research、NIH T-32 Fellowship (CA200561)、および国防総省の膵臓がん研究プログラム (PCARP) 助成金PA210223P1。
Materials
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | NA | Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Passivation reagent |
| 5 mm cover glass | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | Round Glass Coverslips |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | Passivation reagent |
| 28G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | Syringe for cell injection |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic |
| Bench Mount Heat Lamp | McMaster-Carr | 3349K51 | Heat lamp |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Covetrus North America | 059122 | Buprenorphine Analgesia |
| Castroviejo Curved Scissors | World Precision Instruments | WP2220 | Scissor for cutting tissue |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J Mouse |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | Compressed air for drying tissue |
| Cyano acrylate – Gel Superglue | Staples | 234790-6 | Skin Glue |
| Cyano acrylate – Liquid Superglue | Staples | LOC1647358 | Coverslip Glue |
| DPBS 1x | Corning | 21-031-CV | DPBS for cerulein/cell injections |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Graefe Micro Dissecting Forceps |
| Imaging microscope | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Imaging software | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | Isoflurane Anesthesia |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Kim Wipes |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | Laboratory Tape |
| Mouse Dissecting Kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Surgical Instruments |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific Corpo | MSTAT Sensor-MSE | Pulse Oximeter |
| Mouse Surgisuite | Kent Scientific | SURGI-M04 | Heated platform |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory Lotion |
| Oxygen | TechAir | OX TM | Oxygen |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0 | VWR | 95056-872 | Silk Suture |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Life Technologies | 10010-023 | PBS |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Heated Platform Controller |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | Cotton Swabs |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL | Denville Scientific Inc. | P1125 | 100 µL Pipet Tips |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | Vascular Label |
| Window-fixturing plate | NA | NA | Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8]. |
| Window Frame | NA | NA | The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8]. |
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