Stabilisert vindu for intravital avbildning av murinpancreas

Summary

Vi presenterer en protokoll for kirurgisk implantasjon av et stabilisert inneliggende optisk vindu for subcellulær oppløsningsavbildning av murine pancreas, som tillater serielle og langsgående studier av den friske og syke bukspyttkjertelen.

Abstract

Fysiologien og patofysiologien i bukspyttkjertelen er kompleks. Sykdommer i bukspyttkjertelen, som pankreatitt og bukspyttkjerteladenokarsinom (PDAC), har høy sykelighet og dødelighet. Intravital imaging (IVI) er en kraftig teknikk som muliggjør høyoppløselig avbildning av vev i både friske og syke tilstander, noe som muliggjør sanntidsobservasjon av celledynamikk. IVI i murine bukspyttkjertelen gir betydelige utfordringer på grunn av organets dype viscerale og kompatible natur, noe som gjør det svært utsatt for skade og bevegelsesartefakter.

Beskrevet her er prosessen med implantasjon av Stabilisert Window for Intravital avbildning av murine Pancreas (SWIP). SWIP tillater IVI av murine bukspyttkjertelen i normale sunne tilstander, under transformasjonen fra den sunne bukspyttkjertelen til akutt pankreatitt indusert av cerulein, og i ondartede tilstander som bukspyttkjerteltumorer. I forbindelse med genetisk merkede celler eller administrering av fluorescerende fargestoffer, muliggjør SWIP måling av enkeltcelle- og subcellulær dynamikk (inkludert enkeltcelle- og kollektivmigrasjon) samt seriell avbildning av samme interesseregion over flere dager.

Evnen til å fange tumorcellemigrasjon er spesielt viktig, da den primære årsaken til kreftrelatert dødelighet i PDAC er den overveldende metastatiske byrden. Å forstå den fysiologiske dynamikken til metastase i PDAC er et kritisk udekket behov og avgjørende for å forbedre pasientens prognose. Samlet sett gir SWIP forbedret bildestabilitet og utvider anvendelsen av IVI i den sunne bukspyttkjertelen og ondartede bukspyttkjertelsykdommer.

Introduction

Godartede og ondartede bukspyttkjertelsykdommer er potensielt livstruende, med betydelige hull i forståelsen av deres patofysiologi. Pankreatitt-betennelse i bukspyttkjertelen-er den tredje hovedårsaken til gastrointestinale sykdomsrelaterte sykehusinnleggelser og reinnleggelser i USA og er forbundet med betydelig sykelighet, dødelighet og sosioøkonomisk byrde¹. Rangert som den tredje ledende årsaken til kreftrelatert død 2, står bukspyttkjertelduktalt adenokarsinom (PDAC) for de fleste bukspyttkjertelmaligniteter³ og gir en dårlig 5-års overlevelse på bare 11%². Den viktigste årsaken til kreftrelatert dødelighet i PDAC er overveldende metastatisk byrde. Dessverre presenterer de fleste pasienter med metastatisk sykdom. Derfor er forståelse av dynamikken i metastase i PDAC et kritisk udekket behov innen kreftforskning.

Mekanismene som ligger til grunn for betennelse og metastatisk kaskade i bukspyttkjertelen er dårlig forstått. En stor bidragsyter til dette kunnskapsgapet er manglende evne til å observere bukspyttkjertelcellulær dynamikk in vivo. Direkte observasjon av disse cellulære dynamikkene lover å avdekke kritiske mål for å utnytte og forbedre diagnosen og behandlingen av de med bukspyttkjertel sykdom.

Intravital imaging (IVI) er en mikroskopiteknikk som gjør det mulig for forskere å visualisere og studere biologiske prosesser i levende dyr i sanntid. IVI tillater høyoppløselig, direkte visualisering av intracellulær og mikromiljømessig dynamikk in vivo og innenfor det opprinnelige miljøet i den aktuelle biologiske prosessen. Derfor tillater IVI in vivo observasjon av sunne og patologiske prosesser.

Moderne bildebehandlingsmodaliteter for hele kroppen som MR, PET og CT gir utmerket utsikt over hele organer og kan avsløre patologier, selv før utbruddet av kliniske symptomer⁴. De er imidlertid ikke i stand til å oppnå enkeltcelleoppløsning eller avsløre de tidligste stadiene av sykdomspankreatitt eller malignitet.

Tidligere forskning har brukt enkeltcelleoppløsning IVI for å observere godartede og ondartede sykdommer i hud^5,6, bryst⁷, lunge⁸, lever⁹, hjerne 10 og bukspyttkjerteltumorer 11^, noe som fører til innsikt i mekanismer for sykdomsprogresjon ¹². Imidlertid utgjør murine bukspyttkjertelen betydelige hindringer for å oppnå enkeltcelleoppløsning ved bruk av IVI, hovedsakelig på grunn av sin dype viscerale plassering og høy etterlevelse. Videre er det et forgrenet, diffust distribuert organ i mesenteriet som kobles til milten, tynntarmen og magen, noe som gjør det utfordrende å få tilgang til. Vevet er også svært følsomt for bevegelse forårsaket av tilstøtende peristaltikk og respirasjon. Minimering av bevegelse av bukspyttkjertelen er avgjørende for mikroskopi av enkeltcelleoppløsning, da bevegelsesartefakter av selv noen få mikron kan uskarpe og forvrenge bilder, noe som gjør sporing av dynamikken til individuelle celler umulig¹³.

For å utføre IVI, må et abdominal bildevindu (AIW) implanteres kirurgisk ^9,11. For å implantere AIW kirurgisk, sutureres en metallvindusramme inn i bukveggen. Etterpå er interesseorganet festet til rammen ved hjelp av cyanoakrylat lim. Selv om dette er tilstrekkelig for noen stive indre organer (f.eks. lever, milt, stive svulster), blir forsøk på avbildning av den sunne murine bukspyttkjertelen kompromittert av suboptimal lateral og aksial stabilitet på grunn av vevets kompatible tekstur og komplekse arkitektur¹⁴. For å løse denne begrensningen utviklet Park et ^al.14 et bildevindu spesielt designet for den sunne bukspyttkjertelen. Dette Pancreas Imaging Window (PIW) minimerer påvirkning av tarmbevegelse og pust ved å innlemme en horisontal metallhylle i vindusrammen, like under dekselet, stabilisere vevet og opprettholde kontakten med dekselglasset. Mens PIW gir økt sidestabilitet, fant vi at dette vinduet fortsatt demonstrerer aksial drift og i tillegg forhindrer avbildning av store faste svulster på grunn av det smale gapet mellom metallhyllen og dekselet¹⁵.

For å møte disse begrensningene utviklet vi Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP), et implanterbart avbildningsvindu som er i stand til å oppnå stabil langtidsavbildning av både frisk og syk bukspyttkjertel (figur 1)¹⁵. Her gir vi en omfattende protokoll for den kirurgiske prosedyren som brukes til å implantere SWIP. Selv om det primære målet var å studere de dynamiske mekanismene som er involvert i metastase, kan denne metoden også brukes til å utforske ulike aspekter av bukspyttkjertelbiologi og patologi.

Protocol

Alle prosedyrer beskrevet i denne protokollen er utført i samsvar med retningslinjer og forskrifter for bruk av virveldyr, inkludert forhåndsgodkjenning fra Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Passivering av vinduer MERK: Passivering av rustfritt stål renser metallet for forurensninger og skaper et tynt oksidlag som i stor grad øker metallets biokompatibilitet med bløtvev, selv utover titan<…

Representative Results

Figur 1, tilpasset fra Du et al.15, viser bildestillbilder fra en time-lapse IVI-film av murine pancreas. Noe vevsbevegelse kan observeres i løpet av den første sedimenteringsperioden (første time med avbildning, figur 1A). Ved fortsatt bildediagnostikk etter denne sedimenteringsperioden (>75 min) observerte vi imidlertid en økning i lateral og aksial stabilitet (figur 1B). Sammenligningen av stabiliteten…

Discussion

SWIP-protokollen beskrevet her gir en forbedret metode for stabilisering av bukspyttkjertelvev ved å bruke en kryssstingskurvteknikk. Tidlige abdominale bildevinduer (AIW) muliggjorde intravital avbildning (IVI) av indre organer i magen, men begrenset ikke tilstrekkelig bevegelsen av bløtvev som bukspyttkjertelen. Som svar utviklet Park et al. et bukspyttkjertelbildevindu (PIW) som inneholder en horisontal metallhylle og muliggjør forbedret stabilisering av bukspyttkjertelvevet samtidig som kontakten med glassdekselet…

Materials

1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate – Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate – Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].