Vi presenterar ett protokoll för kirurgisk implantation av ett stabiliserat kvarliggande optiskt fönster för subcellulär upplösningsavbildning av den murina bukspottkörteln, vilket möjliggör seriella och longitudinella studier av den friska och sjuka bukspottkörteln.
Bukspottkörtelns fysiologi och patofysiologi är komplex. Sjukdomar i bukspottkörteln, såsom pankreatit och adenocarcinom i bukspottkörteln (PDAC) har hög sjuklighet och dödlighet. Intravital avbildning (IVI) är en kraftfull teknik som möjliggör högupplöst avbildning av vävnader i både friska och sjuka tillstånd, vilket möjliggör observation av celldynamik i realtid. IVI i den murina bukspottkörteln innebär betydande utmaningar på grund av organets djupa, viscerala och följsamma natur, vilket gör det mycket benäget att skadas och rörelseartefakter.
Här beskrivs processen för implantation av S-tabiliserad W-indow för I-ntravitalavbildning av murina P-ancreas(SWIP). SWIP tillåter IVI av den murina bukspottkörteln i normala friska tillstånd, under omvandlingen från den friska bukspottkörteln till akut pankreatit inducerad av cerulein, och i maligna tillstånd som bukspottkörteltumörer. I kombination med genetiskt märkta celler eller administrering av fluorescerande färgämnen möjliggör SWIP mätning av encells- och subcellulär dynamik (inklusive encells- och kollektiv migration) samt seriell avbildning av samma intresseområde under flera dagar.
Förmågan att fånga tumörcellers migration är av särskild betydelse eftersom den primära orsaken till cancerrelaterad dödlighet i PDAC är den överväldigande metastaserande bördan. Att förstå den fysiologiska dynamiken vid metastasering i PDAC är ett kritiskt ouppfyllt behov och avgörande för att förbättra patientens prognos. Sammantaget ger SWIP förbättrad bildstabilitet och utökar tillämpningen av IVI vid friska sjukdomar i bukspottkörteln och maligna bukspottkörtelsjukdomar.
Godartade och elakartade sjukdomar i bukspottkörteln är potentiellt livshotande, med stora luckor i förståelsen av deras patofysiologi. Pankreatit – inflammation i bukspottkörteln – är den tredje stora orsaken till gastrointestinala sjukdomsrelaterade sjukhusinläggningar och återinläggningar i USA och är förknippad med betydande sjuklighet, dödlighet och socioekonomisk börda1. Pankreasduktalt adenokarcinom (PDAC) rankas som den tredje vanligaste orsaken till cancerrelaterad död2 och står för de flesta maligniteter i bukspottkörteln3 och förebådar en dålig 5-årsöverlevnad på endast 11 %2. Den främsta orsaken till cancerrelaterad dödlighet i PDAC är överväldigande metastaserande börda. Tyvärr har de flesta patienter metastaserande sjukdom. Att förstå dynamiken i metastasering i PDAC är därför ett kritiskt otillfredsställt behov inom cancerforskningen.
Mekanismerna som ligger till grund för inflammation och bukspottkörtelns metastaser är dåligt kända. En stor bidragande orsak till denna kunskapslucka är oförmågan att observera cellulär dynamik i bukspottkörteln in vivo. Direkt observation av denna cellulära dynamik lovar att avslöja kritiska mål för att utnyttja och förbättra diagnos och behandling av personer med bukspottkörtelsjukdom.
Intravital avbildning (IVI) är en mikroskopiteknik som gör det möjligt för forskare att visualisera och studera biologiska processer i levande djur i realtid. IVI möjliggör högupplöst, direkt visualisering av intracellulär och mikromiljödynamik in vivo och i den biologiska processens naturliga miljö. Därför tillåter IVI in vivo-observation av friska och patologiska processer.
Samtida helkroppsavbildningsmetoder som MRT, PET och CT erbjuder utmärkta bilder av hela organ och kan avslöja patologier, även innan kliniska symtombörjar 4. De kan dock inte uppnå encellsupplösning eller avslöja de tidigaste stadierna av sjukdomen – pankreatit eller malignitet.
Tidigare forskning har använt encellsupplösning IVI för att observera godartade och maligna sjukdomar i hud5,6, bröst7, lunga8, lever9, hjärna 10 och bukspottkörteltumörer 11, vilket leder till insikter om mekanismer för sjukdomsprogression 12. Den murina bukspottkörteln utgör dock betydande hinder för att uppnå encellsupplösning med IVI, främst på grund av dess djupa viscerala läge och höga följsamhet. Dessutom är det ett grenat, diffust fördelat organ i tarmkäxet som ansluter till mjälten, tunntarmen och magen, vilket gör det svårt att komma åt. Vävnaden är också mycket känslig för rörelse orsakad av intilliggande peristaltik och andning. Att minimera bukspottkörtelns rörelser är viktigt för mikroskopi med encellsupplösning, eftersom rörelseartefakter på bara några mikrometer kan göra bilderna suddiga och förvrängda, vilket gör det omöjligt att spåra dynamiken i enskilda celler13.
För att utföra IVI måste ett bukavbildningsfönster (AIW) opereras 9,11. För att implantera AIW kirurgiskt sys en fönsterram av metall in i bukväggen. Därefter fästs det intressanta organet på ramen med cyanoakrylatlim. Även om detta är tillräckligt för vissa stela inre organ (t.ex. lever, mjälte, stela tumörer), äventyras försök att avbilda den friska murina bukspottkörteln av suboptimal lateral och axiell stabilitet på grund av vävnadens följsamma struktur och komplexa arkitektur14. För att ta itu med denna begränsning utvecklade Park et al.14 ett bildfönster som är särskilt utformat för den friska bukspottkörteln. Detta Pancreas Imaging Window (PIW) minimerar påverkan av tarmrörelser och andning genom att integrera en horisontell metallhylla i fönsterkarmen, precis under täckglaset, vilket stabiliserar vävnaden och bibehåller dess kontakt med täckglaset. Även om PIW erbjuder ökad sidostabilitet, fann vi att detta fönster fortfarande visar axiell drift och dessutom förhindrar avbildning av stora solida tumörer på grund av det smala gapet mellan metallhyllan och täckglaset15.
För att ta itu med dessa begränsningar utvecklade vi Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP), ett implanterbart avbildningsfönster som kan uppnå stabil långtidsavbildning av både den friska och sjuka bukspottkörteln (Figur 1)15. Här tillhandahåller vi ett omfattande protokoll för det kirurgiska ingrepp som används för att implantera SWIP. Även om det primära målet var att studera de dynamiska mekanismerna som är involverade i metastasering, kan denna metod också användas för att utforska olika aspekter av bukspottkörtelns biologi och patologi.
SWIP-protokollet som beskrivs här ger en förbättrad metod för stabilisering av bukspottkörtelvävnad genom att använda en korsstygnskorgsteknik. Tidiga bukavbildningsfönster (AIW) möjliggjorde intravital avbildning (IVI) av inre organ i buken, men begränsade inte tillräckligt rörelsen av mjukvävnader som bukspottkörteln. Som svar på detta utvecklade Park et al. ett pankreasavbildningsfönster (PIW) som innehåller en horisontell metallhylla och möjliggör förbättrad stabilisering av bukspottkörtelns vä…
The authors have nothing to disclose.
Evelyn Lipper Charitable Foundation, Gruss-Lipper Biophotonics Center, Integrated Imaging Program for Cancer Research, ett NIH T-32 Fellowship (CA200561) och ett bidrag från Department of Defense Pancreatic Cancer Research Program (PCARP) PA210223P1.
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | NA | Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning |
5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Passivation reagent |
5 mm cover glass | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | Round Glass Coverslips |
7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | Passivation reagent |
28G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | Syringe for cell injection |
Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic |
Bench Mount Heat Lamp | McMaster-Carr | 3349K51 | Heat lamp |
Buprenorphine 0.3 mg/mL | Covetrus North America | 059122 | Buprenorphine Analgesia |
Castroviejo Curved Scissors | World Precision Instruments | WP2220 | Scissor for cutting tissue |
C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J Mouse |
Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | Compressed air for drying tissue |
Cyano acrylate – Gel Superglue | Staples | 234790-6 | Skin Glue |
Cyano acrylate – Liquid Superglue | Staples | LOC1647358 | Coverslip Glue |
DPBS 1x | Corning | 21-031-CV | DPBS for cerulein/cell injections |
Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Graefe Micro Dissecting Forceps |
Imaging microscope | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
Imaging software | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | Isoflurane Anesthesia |
Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Kim Wipes |
Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | Laboratory Tape |
Mouse Dissecting Kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Surgical Instruments |
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific Corpo | MSTAT Sensor-MSE | Pulse Oximeter |
Mouse Surgisuite | Kent Scientific | SURGI-M04 | Heated platform |
Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory Lotion |
Oxygen | TechAir | OX TM | Oxygen |
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0 | VWR | 95056-872 | Silk Suture |
Phosphate Buffered Saline 1x | Life Technologies | 10010-023 | PBS |
PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Heated Platform Controller |
Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | Cotton Swabs |
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL | Denville Scientific Inc. | P1125 | 100 µL Pipet Tips |
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | Vascular Label |
Window-fixturing plate | NA | NA | Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8]. |
Window Frame | NA | NA | The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8]. |