Procédés d’intégration de réactions de synthèse de protéines acellulaires dans des hydrogels à l’échelle macroscopique
Summary
Nous présentons ici deux protocoles permettant d’intégrer des réactions de synthèse de protéines acellulaires dans des matrices d’hydrogel à l’échelle macroscopique sans avoir besoin d’une phase liquide externe.
Abstract
Les réseaux de gènes synthétiques fournissent une plate-forme aux scientifiques et aux ingénieurs pour concevoir et construire de nouveaux systèmes avec des fonctionnalités codées au niveau génétique. Alors que le paradigme dominant pour le déploiement des réseaux de gènes se trouve à l’intérieur d’un châssis cellulaire, les réseaux de gènes synthétiques peuvent également être déployés dans des environnements sans cellules. Les applications prometteuses des réseaux de gènes acellulaires comprennent les biocapteurs, car ces dispositifs ont été démontrés contre des cibles biotiques (virus Ebola, Zika et SRAS-CoV-2) et abiotiques (métaux lourds, sulfures, pesticides et autres contaminants organiques). Les systèmes acellulaires sont généralement déployés sous forme liquide dans une cuve de réaction. Cependant, être capable d’intégrer de telles réactions dans une matrice physique peut faciliter leur application plus large dans un ensemble plus large d’environnements. À cette fin, des méthodes d’intégration des réactions de synthèse de protéines acellulaires (CFPS) dans une variété de matrices d’hydrogel ont été développées. L’une des principales propriétés des hydrogels propices à ce travail est la grande capacité de reconstitution en eau des matériaux hydrogels. De plus, les hydrogels possèdent des caractéristiques physiques et chimiques fonctionnellement bénéfiques. Les hydrogels peuvent être lyophilisés pour le stockage et réhydratés pour une utilisation ultérieure. Deux protocoles étape par étape pour l’inclusion et le dosage des réactions CFPS dans les hydrogels sont présentés. Tout d’abord, un système CFPS peut être incorporé dans un hydrogel par réhydratation avec un lysat cellulaire. Le système à l’intérieur de l’hydrogel peut alors être induit ou exprimé de manière constitutive pour une expression complète de la protéine à travers l’hydrogel. Deuxièmement, le lysat cellulaire peut être introduit dans un hydrogel au point de polymérisation, et l’ensemble du système peut être lyophilisé et réhydraté à un point ultérieur avec une solution aqueuse contenant l’inducteur du système d’expression codé dans l’hydrogel. Ces méthodes ont le potentiel de permettre la création de réseaux de gènes acellulaires qui confèrent des capacités sensorielles aux matériaux hydrogel, avec un potentiel de déploiement au-delà du laboratoire.
Introduction
La biologie synthétique intègre diverses disciplines d’ingénierie pour concevoir et concevoir des pièces, des dispositifs et des systèmes biologiques qui peuvent remplir des fonctions que l’on ne trouve pas dans la nature. La plupart des approches de biologie synthétique sont encore liées aux cellules vivantes. En revanche, les systèmes de biologie synthétique acellulaires offrent des niveaux de contrôle et de liberté de conception sans précédent, ce qui permet une flexibilité accrue et un temps plus court pour l’ingénierie des systèmes biologiques, tout en éliminant de nombreuses contraintes des méthodes traditionnelles d’expression génique cellulaires 1,2,3. Le CFPS est utilisé dans un nombre croissant d’applications dans de nombreuses disciplines, notamment la construction de cellules artificielles, le prototypage de circuits génétiques, le développement de biocapteurs et la production de métabolites 4,5,6. Le CFPS s’est également avéré particulièrement utile pour produire des protéines recombinantes qui ne peuvent pas être facilement exprimées dans les cellules vivantes, telles que les protéines sujettes à l’agrégation, les protéines transmembranaires et les protéines toxiques 6,7,8.
Le CFPS est généralement effectué dans les réactions liquides. Ceci, cependant, peut limiter leur déploiement dans certaines situations, car tout dispositif sans cellule liquide doit être contenu dans un récipient de réaction. La raison d’être du développement des méthodes présentées ici était de fournir des protocoles robustes pour l’intégration de dispositifs de biologie synthétique acellulaires dans des hydrogels, non pas en tant que plate-forme de production de protéines en soi, mais plutôt pour permettre l’utilisation d’hydrogels comme châssis physique pour le déploiement de dispositifs sans cellules au-delà du laboratoire. L’utilisation d’hydrogels comme châssis CFPS présente plusieurs avantages. Les hydrogels sont des matériaux polymères qui, malgré une teneur élevée en eau (parfois supérieure à 98%), possèdent des propriétés solides 9,10,11. Ils ont des utilisations comme pâtes, lubrifiants et adhésifs et sont présents dans des produits aussi divers que les lentilles de contact, les pansements, les rubans adhésifs marins, les amendements de sol et les couches pour bébés 9,11,12,13,14. Les hydrogels font également l’objet d’études actives en tant que véhicules d’administration de médicaments 9,15,16,17. Les hydrogels peuvent également être biocompatibles, biodégradables et posséder des réponses aux stimuli qui leur sont propres 9,18,19,20. Par conséquent, l’objectif ici est de créer une synergie entre la fonctionnalité dérivée de la biologie moléculaire et la science des matériaux. À cette fin, des efforts ont été faits pour intégrer la biologie synthétique acellulaire à une gamme de matériaux, notamment le collagène, la laponite, le polyacrylamide, la fibrine, le peptide PEG et l’agarose 11,21,22, ainsi que pour recouvrir les surfaces de verre, de papier et de tissu 11,23,24 avec les appareils CFPS. Les protocoles présentés ici démontrent deux méthodes d’intégration des réactions CFPS dans des matrices d’hydrogel à l’échelle macroscopique (c’est-à-dire >1 mm), en utilisant l’agarose comme matériau exemplaire. L’agarose a été choisie en raison de sa grande capacité d’absorption d’eau, de ses propriétés autogélifiantes contrôlées et de ses propriétés mécaniques réglables 11,24,25,26. L’agarose prend également en charge les CFPS fonctionnels, est moins chère que de nombreuses autres alternatives à l’hydrogel et est biodégradable, ce qui en fait un choix attrayant en tant que système modèle expérimental. Cependant, il a déjà été démontré que ces méthodes étaient appropriées pour l’intégration du CFPS dans une gamme d’hydrogels alternatifs11. Compte tenu du large éventail d’applications des hydrogels et de la fonctionnalité des CFPS, les méthodes démontrées ici peuvent fournir une base à partir de laquelle les chercheurs sont en mesure de développer des matériaux hydrogels biologiquement améliorés adaptés à leurs propres fins.
Dans des études antérieures, des systèmes de microgel d’une gamme de tailles de 1 μm à 400 μm ont été utilisés pour effectuer des CFPS dans des hydrogels immergés dans des tampons de réaction 23,27,28,29,30,31. Cependant, l’obligation d’immerger les hydrogels dans les tampons de réaction du CFPS limite les possibilités de leur utilisation en tant que matériaux à part entière. Les protocoles présentés ici permettent aux réactions CFPS de se produire dans les hydrogels sans qu’il soit nécessaire d’immerger les gels dans des tampons de réaction. Deuxièmement, l’utilisation de gels à l’échelle macroscopique (d’une taille comprise entre 2 mm et 10 mm) permet d’étudier l’interaction physique entre les hydrogels et l’expression des gènes acellulaires. Par exemple, avec cette technique, il est possible d’étudier comment la matrice d’hydrogel affecte les réactions CFPS11 et comment les réactions CFPS peuvent avoir un impact sur la matrice d’hydrogel31. Des hydrogels de plus grande taille permettent également le développement de nouveaux matériaux bioprogrammables32. Enfin, l’intégration des réactions CFPS dans les hydrogels permet également de réduire considérablement les besoins en récipients de réaction en plastique. Pour le déploiement de capteurs sans cellules, cela présente des avantages évidents par rapport aux appareils dépendant de la vaisselle en plastique. Dans l’ensemble, l’intégration des réactions CFPS dans les hydrogels offre plusieurs avantages pour le déploiement de dispositifs acellulaires au-delà du laboratoire.
L’objectif global des méthodes présentées ici est de permettre l’exploitation des réactions CFPS au sein de matrices d’hydrogel. Deux méthodes différentes sont démontrées pour intégrer des réactions de production de protéines acellulaires dans des matériaux hydrogel à l’échelle macroscopique (Figure 1). Dans la méthode A, les composants du CFPS sont introduits dans des hydrogels d’agarose lyophilisés pour former un système actif. Dans la méthode B, l’agarose fondue est mélangée avec des composants de réaction CFPS pour former un système complet d’hydrogel CFPS, qui est ensuite lyophilisé et stocké jusqu’à ce que cela soit nécessaire. Ces systèmes peuvent être réhydratés avec un volume d’eau ou un tampon et un analyte pour commencer la réaction.
Cette étude utilise des systèmes à base de lysat de cellules d’Escherichia coli. Ce sont quelques-uns des systèmes expérimentaux CFPS les plus populaires, car la préparation de lysat de cellules E. coli est simple, peu coûteuse et permet d’obtenir des rendements protéiques élevés. Le lysat cellulaire est complété par les composants macromoléculaires nécessaires à la transcription et à la traduction, notamment les ribosomes, les ARNt, les aminoacyl-ARNt synthétases et les facteurs d’initiation, d’élongation et de terminaison. Plus précisément, cet article démontre la production d’eGFP et de mCherry dans des hydrogels d’agarose à l’aide de lysats cellulaires d’E. coli et surveille l’apparence de la fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaques et d’une microscopie confocale. Des résultats représentatifs pour le lecteur de plaques de microtitration peuvent être consultés dans Whitfield et al.31, et les données sous-jacentes sont accessibles au public 33. De plus, l’expression des protéines fluorescentes dans les gels est confirmée par microscopie confocale. Les deux protocoles présentés dans cet article permettent l’assemblage et le stockage de dispositifs génétiques basés sur le CFPS dans des matériaux dans le but ultime de créer un environnement physique approprié pour la distribution de circuits génétiques acellulaires d’une manière favorable au déploiement sur le terrain.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voici deux protocoles pour l’incorporation de réactions CFPS à base de lysat de cellules d’E. coli dans les hydrogels d’agarose. Ces méthodes permettent l’expression simultanée des gènes dans l’ensemble du matériel. Le protocole peut être adapté à d’autres systèmes CFPS et a été mis en œuvre avec succès avec des kits CFPS disponibles dans le commerce en plus des lysats cellulaires préparés en laboratoire détaillés ici. Il est important de noter que le protocole permet l’expression…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient chaleureusement le Conseil de recherches en biotechnologie et en sciences biologiques pour l’appui qu’ils ont accordé aux bourses BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) et BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), ainsi qu’à la bourse EP/N026683/1 du Conseil de recherches en sciences et sciences physiques du Canada (Laboratoires des sciences et technologies de la défense) (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Les données à l’appui de cette publication sont disponibles gratuitement à l’adresse suivante : 10.25405/data.ncl.22232452. Aux fins du libre accès, l’auteur a appliqué une licence Creative Commons Attribution (CC BY) à toute version manuscrite acceptée par l’auteur.
Materials
| Material | |||
| 3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
| Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
| Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
| Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
| CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| GTP | Carbosynth | NG01208 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
| Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
| 10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
| 15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
| Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
| Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
| Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
| Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
| JMP license | SAS Institute | 15 | |
| Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
| Parafilm | Amcor | PM-966 | |
| Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
| Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
| Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
| Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
| Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
| Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
| Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
| VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |
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