במאמר זה אנו מציגים שני פרוטוקולים להטמעת תגובות סינתזת חלבונים נטולי תאים במטריצות הידרוג’ל בקנה מידה מאקרו ללא צורך בפאזה נוזלית חיצונית.
רשתות גנים סינתטיות מספקות פלטפורמה למדענים ומהנדסים לתכנן ולבנות מערכות חדשניות עם פונקציונליות המקודדת ברמה גנטית. בעוד הפרדיגמה השלטת לפריסת רשתות גנים היא בתוך שלדה תאית, רשתות גנים סינתטיות עשויות להיות פרוסות גם בסביבות נטולות תאים. יישומים מבטיחים של רשתות גנים נטולות תאים כוללים ביו-חיישנים, שכן התקנים אלה הוכחו נגד מטרות ביוטיות (נגיפי אבולה, זיקה ו-SARS-CoV-2) וא-ביוטיות (מתכות כבדות, סולפידים, חומרי הדברה ומזהמים אורגניים אחרים). מערכות נטולות תאים נפרסות בדרך כלל בצורה נוזלית בתוך כלי תגובה. היכולת להטמיע תגובות כאלה במטריצה פיזיקלית, לעומת זאת, עשויה להקל על היישום הרחב יותר שלהן בקבוצה רחבה יותר של סביבות. לשם כך פותחו שיטות להטמעת תגובות סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) במגוון מטריצות הידרוג’ל. אחד המאפיינים העיקריים של הידרוג’לים התורמים לעבודה זו הוא יכולת הבנייה מחדש של מים גבוהים של חומרי הידרוג’ל. בנוסף, הידרוג’לים הם בעלי מאפיינים פיזיקליים וכימיים המועילים מבחינה תפקודית. ניתן לייבש הידרוג’לים בהקפאה לאחסון ולהתייבש מחדש לשימוש מאוחר יותר. מוצגים שני פרוטוקולים שלב אחר שלב להכללה ובדיקה של תגובות CFPS בהידרוג’לים. ראשית, ניתן לשלב מערכת CFPS בהידרוג’ל באמצעות התייבשות עם ליזט תא. לאחר מכן ניתן להשרות או לבטא את המערכת בתוך ההידרוג’ל באופן קונסטיטוטיבי לביטוי חלבוני מלא באמצעות ההידרוג’ל. שנית, ניתן להחדיר לליזט התא הידרוג’ל בנקודת הפילמור, וניתן לייבש את המערכת כולה בהקפאה ולהתייבש מחדש בנקודה מאוחרת יותר באמצעות תמיסה מימית המכילה את השראת מערכת הביטוי המקודדת בתוך ההידרוג’ל. לשיטות אלה יש פוטנציאל לאפשר רשתות גנים נטולות תאים המקנות יכולות חושיות לחומרי הידרוג’ל, עם פוטנציאל לפריסה מעבר למעבדה.
ביולוגיה סינתטית משלבת דיסציפלינות הנדסיות מגוונות כדי לתכנן ולהנדס חלקים, התקנים ומערכות מבוססי ביולוגיה שיכולים לבצע פונקציות שאינן נמצאות בטבע. רוב גישות הביולוגיה הסינתטית עדיין קשורות לתאים חיים. לעומת זאת, מערכות ביולוגיה סינתטית נטולות תאים מאפשרות רמות חסרות תקדים של שליטה וחופש בתכנון, ומאפשרות גמישות מוגברת וקיצור זמן להנדסת מערכות ביולוגיות תוך ביטול רבים מהאילוצים של שיטות מסורתיות לביטוי גנים מבוססי תאים 1,2,3. CFPS נמצא בשימוש במספר גדל והולך של יישומים על פני דיסציפלינות רבות, כולל בניית תאים מלאכותיים, אב טיפוס של מעגלים גנטיים, פיתוח biosensors, וייצור מטבוליטים 4,5,6. CFPS היה גם שימושי במיוחד לייצור חלבונים רקומביננטיים שאינם יכולים להתבטא בקלות בתאים חיים, כגון חלבונים נוטים לצבירה, חלבונים טרנסממברנליים וחלבונים רעילים 6,7,8.
CFPS מבוצע בדרך כלל בתגובות נוזליות. עם זאת, זה עשוי להגביל את פריסתם במצבים מסוימים, שכן כל מכשיר נוזלי ללא תאים חייב להיות כלול בתוך כלי תגובה. הרציונל לפיתוח השיטות שהוצגו כאן היה לספק פרוטוקולים חזקים להטמעת התקנים ביולוגיים סינתטיים נטולי תאים בהידרוג’לים, לא כפלטפורמה לייצור חלבונים כשלעצמה, אלא לאפשר שימוש בהידרוג’לים כמארז פיזי לפריסת התקנים נטולי תאים מעבר למעבדה. לשימוש בהידרוג’לים כמארז CFPS יש מספר יתרונות. הידרוג’לים הם חומרים פולימריים שלמרות תכולת מים גבוהה (לפעמים מעל 98%), הם בעלי תכונות מוצקות 9,10,11. יש להם שימושים כמו משחות, חומרי סיכה ודבקים והם נמצאים במוצרים מגוונים כמו עדשות מגע, תחבושות פצעים, סרטי דבק ימיים, משפרי קרקע וחיתולים לתינוקות 9,11,12,13,14. הידרוג’לים נמצאים גם הם תחת חקירה פעילה כרכבי משלוח סמים 9,15,16,17. הידרוג’לים עשויים גם להיות תואמים ביולוגית, מתכלים, ויש להם כמה תגובות גירוי משלהם 9,18,19,20. לכן, המטרה כאן היא ליצור סינרגיה בין פונקציונליות הנגזרת מביולוגיה מולקולרית לבין מדע החומרים. לשם כך נעשו מאמצים לשלב ביולוגיה סינתטית נטולת תאים עם מגוון חומרים, כולל קולגן, לפוניט, פוליאקרילאמיד, פיברין, פפטיד PEG ואגרוז 11,21,22, כמו גם לצפות משטחי זכוכית, נייר ובד 11,23,24 עם מכשירי CFPS. הפרוטוקולים המוצגים כאן מדגימים שתי שיטות להטמעת תגובות CFPS במטריצות הידרוג’ל בקנה מידה מאקרו (כלומר, >1 מ”מ), תוך שימוש באגרוז כחומר לדוגמה. אגרוז נבחרה בשל יכולת ספיגת המים הגבוהה שלה, תכונות הג’ל העצמי המבוקרות והתכונות המכניות הניתנות לכוונון 11,24,25,26. Agarose תומך גם CFPS פונקציונלי, הוא זול יותר מאשר חלופות הידרוג’ל רבות אחרות, והוא מתכלה, מה שהופך אותו בחירה אטרקטיבית כמערכת מודל ניסיוני. עם זאת, שיטות אלה הוכחו בעבר כמתאימות להטמעת CFPS במגוון הידרוג’לים חלופיים11. בהתחשב במגוון הרחב של יישומים של הידרוג’לים ואת הפונקציונליות של CFPS, השיטות שהודגמו כאן יכול לספק בסיס שממנו החוקרים מסוגלים לפתח חומרי הידרוג’ל משופרים ביולוגית המתאימים למטרותיהם.
במחקרים קודמים, מערכות מיקרוג’ל בטווח גדלים של 1 מיקרומטר עד 400 מיקרומטר שימשו לביצוע CFPS בהידרוג’לים השקועים בחיץ תגובה 23,27,28,29,30,31. עם זאת, הדרישה לטבול הידרוג’לים בתוך מאגרי התגובה של CFPS מגבילה את ההזדמנויות לפריסתם כחומרים בפני עצמם. הפרוטוקולים המוצגים כאן מאפשרים לתגובות CFPS להתרחש בתוך הידרוג’לים ללא צורך להטביע את הג’לים במאגרי תגובה. שנית, השימוש בג’לים בקנה מידה מאקרו (בין 2 מ”מ ל-10 מ”מ) מאפשר לחקור את האינטראקציה הפיזית בין הידרוג’לים לבין ביטוי גנים נטולי תאים. לדוגמה, באמצעות טכניקה זו, ניתן ללמוד כיצד מטריצת הידרוג’ל משפיעה על תגובות CFPS11 וכיצד תגובות CFPS יכולות להשפיע על מטריצת הידרוג’ל31. גדלים גדולים יותר של הידרוג’לים מאפשרים גם פיתוח של חומרים חדשניים הניתנים לתכנות ביולוגי32. לבסוף, על ידי הטמעת תגובות CFPS לתוך הידרוג’לים, יש גם הפחתה פוטנציאלית בדרישה לכלי תגובה פלסטיים. עבור פריסת חיישנים ללא תאים, יש לכך יתרונות ברורים על פני מכשירים התלויים בתוכנות פלסטיק. יחד, הטמעת תגובות CFPS בהידרוג’לים מספקת מספר יתרונות לפריסה של התקנים נטולי תאים מעבר למעבדה.
המטרה הכוללת של השיטות המוצגות כאן היא לאפשר פעולה של תגובות CFPS בתוך מטריצות הידרוג’ל. שתי שיטות שונות מודגמות להטמעת תגובות ייצור חלבון ללא תאים בחומרי הידרוג’ל בקנה מידה מאקרו (איור 1). בשיטה A, רכיבי CFPS מוכנסים להידרוג’ל אגרוז ליופילי כדי ליצור מערכת פעילה. בשיטה B, אגרוז מותך מעורבב עם רכיבי תגובת CFPS כדי ליצור מערכת הידרוג’ל CFPS שלמה, אשר לאחר מכן עוברת ליופיליזציה ומאוחסנת עד לצורך. מערכות אלה יכולות להיות מיובשות מחדש עם נפח של מים או חיץ ולנתח כדי להתחיל את התגובה.
מחקר זה משתמש במערכות מבוססות תאי ליזט Escherichia coli. אלו הן חלק ממערכות CFPS הניסיוניות הפופולריות ביותר, שכן הכנת תאי אי קולי ליזט היא פשוטה, זולה ומשיגה תפוקות חלבון גבוהות. ליזט התא משלים עם המרכיבים המקרומולקולריים הדרושים לביצוע שעתוק ותרגום, כולל ריבוזומים, tRNAs, סינתזות אמינואציל-tRNA, וגורמי ייזום, התארכות וסיום. באופן ספציפי, מאמר זה מדגים את הייצור של eGFP ו mCherry בהידרוג’לים agarose באמצעות תאי E. coli lysates ועוקב אחר המראה של פלואורסצנטיות באמצעות קורא לוחות ומיקרוסקופ קונפוקלי. תוצאות מייצגות עבור קורא לוחות microtiter ניתן לראות Whitfield et al.31, ואת הנתונים הבסיסיים זמינים לציבור 33. יתר על כן, הביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים לאורך הג’לים מאושר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. שני הפרוטוקולים שהודגמו במאמר זה מאפשרים הרכבה ואחסון של התקנים גנטיים מבוססי CFPS במאטריה במטרה הסופית ליצור סביבה פיזית מתאימה להפצה של מעגלי גנים נטולי תאים באופן התומך בפריסת השדה.
להלן שני פרוטוקולים לשילוב תגובות CFPS מבוססות תאי E. coli ליזט בהידרוג’לים של אגרוז. שיטות אלו מאפשרות ביטוי גנים בו זמנית בכל החומר. ניתן להתאים את הפרוטוקול למערכות CFPS אחרות והוא נערך בהצלחה עם ערכות CFPS זמינות מסחרית בנוסף לליזטים התאיים שהוכנו במעבדה המפורטים כאן. חשוב לציין כי הפרוטו?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים מאוד על תמיכתם של פרסי מועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) ו- BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), ופרס EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H). נתונים התומכים בפרסום זה זמינים באופן גלוי בכתובת: 10.25405/data.ncl.22232452. לצורך גישה פתוחה, המחבר החיל רישיון Creative Commons Attribution (CC BY) על כל גרסה של כתב היד המקובל על המחבר.
Material | |||
3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
GTP | Carbosynth | NG01208 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
PEG-8000 | Promega | V3011 | |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
Equipment | |||
1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
JMP license | SAS Institute | 15 | |
Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
Parafilm | Amcor | PM-966 | |
Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |