マクロスケールハイドロゲルへの無細胞タンパク質合成反応の埋め込み法
Summary
ここでは、外液相を必要とせずに、無細胞タンパク質合成反応をマクロスケールのヒドロゲルマトリックスに組み込むための2つのプロトコルを紹介します。
Abstract
合成遺伝子ネットワークは、科学者やエンジニアが遺伝子レベルでエンコードされた機能を備えた新しいシステムを設計および構築するためのプラットフォームを提供します。遺伝子ネットワークの展開のための支配的なパラダイムは細胞シャーシ内にありますが、合成遺伝子ネットワークは無細胞環境でも展開できます。無細胞遺伝子ネットワークの有望な用途には、バイオセンサーが含まれ、これらのデバイスは生物(エボラ、ジカ、およびSARS-CoV-2ウイルス)および非生物的(重金属、硫化物、農薬、およびその他の有機汚染物質)の標的に対して実証されています。無細胞システムは通常、反応容器内に液体の形で展開されます。しかし、このような反応を物理マトリックスに埋め込むことができれば、より広い環境でのより広範な適用が容易になる可能性があります。この目的のために、無細胞タンパク質合成(CFPS)反応を様々なヒドロゲルマトリックスに組み込む方法が開発されている。この作業に役立つヒドロゲルの重要な特性の1つは、ヒドロゲル材料の高い水再構成能力です。さらに、ヒドロゲルは、機能的に有益な物理的および化学的特性を有する。ヒドロゲルは、貯蔵のために凍結乾燥し、後で使用するために再水和することができる。ヒドロゲルにCFPS反応を含めることとアッセイするための2つの段階的なプロトコルが提示されます。まず、CFPSシステムは、細胞ライセートによる再水和 を介して ヒドロゲルに組み込むことができます。次いで、ヒドロゲル内の系を構成的に誘導または発現させて、ヒドロゲルを介した完全なタンパク質発現を得ることができる。第2に、細胞ライセートを重合時点でヒドロゲルに導入することができ、システム全体を凍結乾燥し、ヒドロゲル内にコードされた発現系の誘導物質を含む水溶液で後で再水和することができる。これらの方法は、ヒドロゲル材料に感覚能力を付与する無細胞遺伝子ネットワークを可能にする可能性があり、実験室を超えて展開する可能性があります。
Introduction
合成生物学は、多様な工学分野を統合して、自然界には見られない機能を実行できる生物学的ベースの部品、デバイス、およびシステムを設計およびエンジニアリングします。ほとんどの合成生物学のアプローチは、依然として生細胞に結びついています。対照的に、無細胞合成生物学システムは、前例のないレベルの制御と設計の自由度を促進し、従来の細胞ベースの遺伝子発現法の制約の多くを排除しながら、生物学的システムのエンジニアリングの柔軟性を高め、時間を短縮します1,2,3。CFPSは、人工細胞の構築、遺伝子回路のプロトタイピング、バイオセンサーの開発、代謝物の生成など、多くの分野でますます多くのアプリケーションで使用されています4,5,6。CFPSは、凝集しやすいタンパク質、膜貫通タンパク質、毒性タンパク質など、生細胞では容易に発現できない組換えタンパク質の産生にも特に有用です6,7,8。
CFPSは通常、液体反応で行われます。ただし、液体セルフリーデバイスを反応容器内に封じ込める必要があるため、状況によっては展開が制限される可能性があります。ここで紹介したメソッドの開発の理論的根拠は、無細胞合成生物学デバイスをヒドロゲルに組み込むための堅牢なプロトコルを提供することであり、タンパク質生産プラットフォーム自体としてではなく、代わりに、実験室を超えてセルフリーデバイスを展開するための物理的なシャーシとしてヒドロゲルを使用できるようにすることでした。CFPSシャーシとしてヒドロゲルを使用することには、いくつかの利点があります。ヒドロゲルは、高い含水量(時には98%を超える)にもかかわらず、固体特性9,10,11を有する高分子材料である。それらはペースト、潤滑剤、接着剤として用途があり、コンタクトレンズ、創傷被覆材、船舶用粘着テープ、土壌改良剤、ベビーおむつなど、さまざまな製品に含まれています9,11,12,13,14。ヒドロゲルはまた、薬物送達ビヒクルとして活発に研究されている9、15、16、17。ヒドロゲルはまた、生体適合性、生分解性であり得、そしてそれら自身のいくつかの刺激応答を有する9、18、19、20。したがって、ここでの目標は、分子生物学由来の機能と材料科学の相乗効果を生み出すことです。この目的のために、無細胞合成生物学をコラーゲン、ラポナイト、ポリアクリルアミド、フィブリン、PEGペプチド、アガロース11,21,22などのさまざまな材料と統合し、ガラス、紙、布の表面をコーティングする努力がなされてきました11,23,24CFPS デバイスで使用します。ここで紹介するプロトコルは、アガロースを例示的な材料として使用して、CFPS反応をマクロスケール(すなわち>1 mm)のヒドロゲルマトリックスに埋め込むための2つの方法を示しています。アガロースは、その高い吸水能力、制御された自己ゲル化特性、および調整可能な機械的特性のために選択されました11、24、25、26。また、アガロースは機能性CFPSをサポートし、他の多くのヒドロゲル代替品よりも安価で、生分解性であるため、実験モデルシステムとして魅力的な選択肢となっています。しかしながら、これらの方法は、代替ヒドロゲル11の範囲にCFPSを埋め込むのに適切であると以前に実証されている。ヒドロゲルの幅広い用途とCFPSの機能性を考慮すると、ここで実証された方法は、研究者が自分の目的に適した生物学的に強化されたヒドロゲル材料を開発するための基礎を提供することができます。
以前の研究では、1μmから400μmのサイズ範囲のミクロゲル系を使用して、反応バッファー23、27、28、29、30、31に沈めたヒドロゲルでCFPSを実行しました。しかし、CFPS反応バッファー内にヒドロゲルを沈める必要があるため、それ自体が材料として展開する機会が制限されます。ここに示すプロトコルにより、ゲルを反応バッファーに沈めることなく、ヒドロゲル内でCFPS反応を行うことができます。第二に、マクロスケールゲル(サイズが2 mmから10 mm)を使用すると、ヒドロゲルと無細胞遺伝子発現との間の物理的相互作用の研究が可能になります。例えば、この技術により、ヒドロゲルマトリックスがCFPS反応11にどのように影響し、CFPS反応がヒドロゲルマトリックス31にどのように影響し得るかを研究することができる。より大きなサイズのヒドロゲルはまた、新規のバイオプログラム可能な材料の開発を可能にする32。最後に、CFPS反応をヒドロゲルに組み込むことにより、プラスチック反応容器の要件も削減できる可能性があります。セルフリーセンサーの展開では、プラスチック製品に依存するデバイスに比べて明らかな利点があります。まとめると、CFPS反応をヒドロゲルに組み込むことは、実験室を超えてセルフリーデバイスを展開するためのいくつかの利点を提供します。
ここで紹介する方法の全体的な目標は、ヒドロゲルマトリックス内でCFPS反応を操作できるようにすることです。無細胞タンパク質生産反応をマクロスケールのヒドロゲル材料に組み込むための2つの異なる方法が実証されています(図1)。 方法Aでは、CFPS成分を凍結乾燥アガロースヒドロゲルに導入して活性系を形成します。 方法Bでは、溶融アガロースをCFPS反応成分と混合して完全なCFPSヒドロゲルシステムを形成し、凍結乾燥して必要になるまで保管します。これらのシステムは、反応を開始するために、大量の水またはバッファーと分析物で再水和することができます。
この研究では、 大腸菌 細胞ライセートベースのシステムを使用しています。 これらは、大腸菌 細胞ライセートの調製が簡単で安価であり、高いタンパク質収率を達成するため、最も人気のある実験用CFPSシステムの一部です。細胞ライセートは、リボソーム、tRNA、アミノアシルtRNA合成酵素、開始因子、伸長因子、終結因子など、転写および翻訳の実行に必要な高分子成分で補完されます。具体的には、この論文では、 大腸菌 細胞ライセートを使用したアガロースヒドロゲルでのeGFPおよびmCherryの生産を実証し、プレートリーダーと共焦点顕微鏡を使用して蛍光の出現を監視します。マイクロタイタープレートリーダーの代表的な結果はWhitfieldら31に見られ、基礎となるデータは公開されている33。さらに、ゲル全体にわたる蛍光タンパク質の発現は、共焦点顕微鏡を用いて確認される。この論文で実証された2つのプロトコルは、フィールド展開をサポートする方法で無細胞遺伝子回路の分布に適した物理的環境を作り出すことを最終目標として、 マテリアでの CFPSベースの遺伝子デバイスの組み立てと保存を可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、 大腸菌 細胞ライセートベースのCFPS反応をアガロースヒドロゲルに組み込むための2つのプロトコルについて概説します。これらの方法は、材料全体で同時に遺伝子発現を可能にします。このプロトコルは、他のCFPSシステムにも適用でき、ここで詳しく説明する実験室で調製された細胞ライセートに加えて、市販のCFPSキットを使用して成功裏に実施されています。重要なこ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、バイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会賞BB/V017551/1(S.K.、T.P.H.)およびBB/W01095X/1(A.L.、T.P.H.)、および工学物理科学研究評議会-防衛科学技術研究所賞EP/N026683/1(C.J.W.、A.M.B.、T.P.H.)の支援に大いに感謝しています。この出版物を裏付けるデータは、10.25405/data.ncl.22232452で公開されています。オープンアクセスの目的で、著者は、著者が受理した原稿のバージョンにクリエイティブコモンズ表示(CC BY)ライセンスを適用しています。
Materials
| Material | |||
| 3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
| Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
| Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
| Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
| CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| GTP | Carbosynth | NG01208 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
| Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
| 10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
| 15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
| Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
| Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
| Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
| Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
| JMP license | SAS Institute | 15 | |
| Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
| Parafilm | Amcor | PM-966 | |
| Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
| Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
| Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
| Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
| Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
| Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
| Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
| VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |
References
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