يحدد هذا البحث تقنيتين لعزل مصائد العدلات خارج الخلية الوفيرة (NETs) من نخاع عظم الفئران. تجمع إحدى الطرق بين مجموعة عزل العدلات التجارية والطرد المركزي المتدرج للكثافة ، بينما تستخدم الطريقة الأخرى الطرد المركزي المتدرج للكثافة فقط. كلا النهجين يتمخضان عن شبكات وظيفية تفوق تلك الموجودة في العدلات الدموية المحيطية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نهج فريد لعزل العدلات نخاع عظم الفئران بسعة مماثلة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كان الهدف الأساسي من هذا البحث هو تطوير نهج موثوق وفعال لعزل مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) من نخاع عظم الفئران. نشأ هذا الجهد بسبب القيود المرتبطة بالطريقة التقليدية لاستخراج الشبكات من الدم المحيطي ، ويرجع ذلك أساسا إلى ندرة العدلات المتاحة للعزل. كشفت الدراسة عن منهجيتين متميزتين للحصول على العدلات الفئران من نخاع العظام: إجراء مبسط من خطوة واحدة أسفر عن مستويات تنقية مرضية ، وعملية من خطوتين أكثر كثافة للوقت أظهرت كفاءة تنقية معززة. الأهم من ذلك ، أن كلتا التقنيتين أسفرت عن كمية كبيرة من العدلات القابلة للحياة ، تتراوح بين 50 إلى 100 مليون لكل فئران. عكست هذه الكفاءة النتائج التي تم الحصول عليها من عزل العدلات من كل من المصادر البشرية والفئران. بشكل ملحوظ ، أظهرت العدلات المشتقة من نخاع عظم الفئران قدرات مماثلة لإفراز الشبكات عند مقارنتها بالعدلات التي تم الحصول عليها من الدم المحيطي. ومع ذلك ، فإن الطريقة القائمة على نخاع العظم أنتجت باستمرار كميات أكبر بشكل ملحوظ من كل من العدلات و NETs. أظهر هذا النهج إمكانية الحصول على كميات أكبر بكثير من هذه المكونات الخلوية لمزيد من التطبيقات النهائية. والجدير بالذكر أن هذه الشبكات المعزولة والعدلات تبشر بمجموعة من التطبيقات ، تغطي مجالات الالتهاب والعدوى وأمراض المناعة الذاتية.
المقدمة
تشكل العدلات مجموعة فرعية حرجة من كريات الدم البيضاء التي تلعب دورا محوريا في الاستجابة المناعية الفطرية. وهي تتميز بنوى وحبيبات متعددة الفصوص تحتوي على مختلف البروتياز والببتيدات المضادة للميكروبات1. تعمل العدلات بشكل أساسي من خلال التحلل ، البلعمة ، وتشكيل NETs. تم إجراء ملاحظة الشبكات لأول مرة بواسطة Takei et al. في عام 1996 خلال تجربة حيث تم تحفيز العدلات باستخدام أسيتات فوربول ميريستات (PMA) 2. في وقت لاحق ، تمت صياغة عملية تكوين NET "NETosis" بواسطة Brinkmann et al.3 في عام 2004. سلط بحثهم الضوء على الدور الحاسم لشبكات NETs في استجابات مضادات الميكروبات بوساطة العدلات. الشبكات عبارة عن هياكل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء الدراسة بموجب ترخيص مشروع (رقم 20211404A) ممنوح من قبل لجنة أخلاقيات في مستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان ، وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات في مستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان لرعاية واستخدام. وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية ، تم الحفاظ على الفئران المستخدمة في هذه الدراسة في بيئة خاضعة للرقابة مع دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة ، ودرجة حرارة عند 22-24 درجة مئوية ورطوبة 50٪ -60٪. تم منح الفئران إمكانية الوصول إلى الطعام والماء حسب الطلب. كانت المستخدمة في هذه الدراسة من ذكور الفئران Sprague Dawley (SD) البالغة من العمر 6-8 أسابيع ، ويزن حوالي 250 جراما وخالية من مسببات الأمراض. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يحدد البروتوكول الموضح هنا طريقتين متميزتين ، تتميز كل منهما بتنقية محسنة أو خطوات مبسطة. أسفرت كلتا الطريقتين عن حوالي 0.5 × 108-1 × 108 عدلات لكل فئران. أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي ، باستخدام مجموعة الكشف عن موت الخلايا المبرمج V-FITC / PI المرفقة ، صلاحية الخلية أعلى من 90٪ ، مقارنة بنظرائهم من الفئران والبشر (الشكل 1). بينما بدا تلوث الخلايا اللمفاوية أمرا لا مفر منه أثناء عزل العدلات من نخاع العظام ، أظهرت الطريقة المكونة من خطوتين مستوى نقاء محسن بنسبة 90٪ مقارن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يشكل عزل العدلات خطوة محورية في دراسة NETosis ، حيث يكون اختيار طريقة العزل المناسبة أمرا بالغ الأهمية للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها. أحد العوامل المهمة التي يجب وزنها هو حدوث تلوث الخلايا اللمفاوية أثناء العزل. تعتبر معالجة هذا التحدي مهمة بشكل خاص عند عزل عدلات الفئران عن نخاع العظام. على الرغم من نطاق الكثافة المميز للعدلات (1.0814-1.0919 ، مع ذروة عند 1.0919) مقارنة بالخلايا الليمفاوية (1.0337-1.0765 ، مع ذروة عند 1.0526) ، لا يزال التلوث بالخلايا الليمفاوية أمرا لا مفر منه. يمكن أن يعزى ذلك جزئيا إلى وفرة الخ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
شكر وتقدير
التمويل: تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (أرقام 82004154 و 81900311 و 82100336 و 81970345).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| A488 - الحمار المترافق مضاد للأرانب IgG (H + L) | Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية | A32790 | |
| A594 حمار مترافق مضاد للفأر IgG (H + L) | Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية | A32744 | |
| A594 الماعز المترافق المضاد للفأر IgG1 ؛ | Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية | A21125 | |
| مضاد للفئران مايلوبيروكسيداز | Abcam ، إنجلترا | ab134132 | |
| مضاد للعدلات العدلات إيلاستا | Abcam ، إنجلترا | ab21595 | |
| خلوي صورة السبريد | Necelelom ، الولايات المتحدة الأمريكية | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma ، الولايات المتحدة الأمريكية | 10104159001 | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | جيبكو ، الولايات المتحدة الأمريكية | 10099141 سي | |
| هانك s محلول الملح المتوازن (HBSS) | جيبكو ، الولايات المتحدة الأمريكية | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher ، الولايات المتحدة الأمريكية | 33342 | |
| Isoflurane | RWD ، الصين | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma ، الولايات المتحدة الأمريكية | 81381 | |
| مصل الحمار العادي | Solarbio ، الصين | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp ، الصين | BL539A | |
| البنسلين ستربتومايسين | هيكلون ، الولايات المتحدة الأمريكية | SV30010 | |
| Percoll | GE ، الولايات المتحدة الأمريكية | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myrisstate 13-acetate (PMA) | Sigma ، الولايات المتحدة الأمريكية | ؛ P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية | P11496 | |
| طقم عزل عدلات الفئران | Solarbio ، الصين | P9200 | |
| عازلة تحلل خلايا الدم الحمراء | Solarbio ، الصين | R1010 | |
| معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) وسائل الإعلام | Hyclone ، الولايات المتحدة | الأمريكية SH30809.01B | |
| RWD آلة التخدير الحيواني العالمي | RWD ، الصين | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) الفئران | Dashuo ، الصين | ||
| SytoxGreen | Thermofisher ، الولايات المتحدة الأمريكية | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) عازلة | Solarbio ، الصين | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx ، الألمانية | 1139ML100 |
المراجع
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
