이 연구는 쥐의 골수에서 풍부한 호중구 세포외 트랩(NET)을 분리하는 두 가지 기술을 간략하게 설명합니다. 한 가지 방법은 상용 호중구 분리 키트와 밀도 구배 원심분리를 결합하는 반면, 다른 방법은 밀도 구배 원심분리만 사용합니다. 두 접근법 모두 말초 혈액 호중구의 NET을 능가하는 기능적 NET을 산출합니다.
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방법 논문
비슷한 용량의 쥐 골수 호중구를 분리하기 위한 독특한 접근법
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
이 연구의 주요 목표는 쥐 골수에서 호중구 세포외 트랩(NET)을 분리하기 위한 신뢰할 수 있고 효율적인 접근 방식을 개발하는 것이었습니다. 이러한 노력은 말초 혈액에서 NET을 추출하는 전통적인 방법과 관련된 제한으로 인해 발생했으며, 주로 분리에 사용할 수 있는 호중구가 부족하기 때문입니다. 이 연구는 골수에서 쥐 호중구를 얻기 위한 두 가지 뚜렷한 방법론, 즉 만족스러운 정제 수준을 산출하는 간소화된 1단계 절차와 향상된 정제 효율을 나타내는 더 많은 시간 집약적인 2단계 프로세스를 보여주었습니다. 중요한 것은, 두 기술 모두 쥐 한 마리당 5천만에서 1억 마리에 이르는 상당한 양의 생존 가능한 호중구를 산출했다는 것입니다. 이 효율성은 인간과 쥐 공급원 모두에서 호중구를 분리하여 얻은 결과를 반영했습니다. 의미심장하게도, 쥐의 골수에서 유래한 호중구는 말초 혈액에서 얻은 호중구와 비교할 때 NET을 분비하는 능력이 비슷했습니다. 그러나 골수 기반 방법은 지속적으로 호중구와 NET을 모두 현저하게 더 많이 생산했습니다. 이 접근법은 추가 다운스트림 응용 분야를 위해 이러한 세포 구성 요소를 훨씬 더 많이 얻을 수 있는 잠재력을 보여주었습니다. 특히, 이러한 분리된 NET과 호중구는 염증, 감염 및 자가면역 질환의 영역에 걸쳐 다양한 응용 분야에 대한 가능성을 가지고 있습니다.
서론
호중구는 선천성 면역 반응에서 중추적인 역할을 하는 백혈구의 중요한 하위 집합을 구성합니다. 이들은 다양한 프로테아제와 항균 펩타이드를 함유하는 다엽 핵과 과립을 특징으로 한다1. 호중구는 주로 탈과립화, 식균작용 및 NET의 형성을 통해 기능합니다. NET의 관찰은 1996년 Takei et al.이 호중구를 phorbol myristate acetate(PMA)2로 자극하는 실험에서 처음 이루어졌습니다. 그 후, NET 형성 과정은 2004년 Brinkmann et al.3에 의해 "NETosis"라는 용어로 만들어졌습니다. 그들의 연구는 호중구 매개 항균 반응에서 NET의 중요한 역할을 더욱 조명했습니다. NET은 크로마틴, 히스톤 및 항균 단백질로 구성된 거미줄 모양의 구조로, 감염성 및 염증성 자극에 반응하여 활성화된 호중구에서 방출됩니다. NET은 침입하는 병원체를 가두고 고농도의 항균 펩타이드와 프로테아제에 노출시켜 고정시키고 죽일 수 있습니다 1,3. 또한 NET은 자가사멸 세포의 청소에 기여하고 염증 해결에 관여합니다. 최근 연구에 따르면 NET....
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프로토콜
이 연구는 쓰촨 대학 화서부 병원 동물 윤리 위원회의 동물 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 쓰촨 대학교 중국 서부 병원 동물 윤리 위원회가 부여한 프로젝트 라이선스(No. 20211404A)에 따라 수행되었습니다. 윤리 지침에 따라 이 연구에 사용된 쥐는 12시간 명암 주기, 온도 22-24°C 및 습도 50%-60%의 통제된 환경에서 유지되었습니다. 쥐들은 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있게 되었다. 이 연구에 사용된 동물은 6-8주 된 Sprague Dawley(SD) 수컷 쥐였으며 무게는 약 250g이고 특정 병원체가 없었습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다( 자료표 참조).
1. 쥐 호중구의 분리
- 골수 채취
- 마취를 위해 쥐를 적절한 용기에 넣으십시오( 재료 표 참조). 동물이 의식을 잃을 때까지 쥐에게 3% 이소플루란을 투여합니다. 마취 깊이를 확인하기 위해 발가락 꼬집기 또는 꼬리 꼬집음에 반응이 없는지 확인하십시오.
- 쥐가 깊이 마취되면 쥐를 등에 눕히고 한 손으로 꼬리를 잡고 다른 손으로 머리를 잡고 경추 탈구를 수행합니다. 경추가 절단될 때까지 머리를 아래로 당기면서 꼬리에 갑작스럽고 ....
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결과
여기에 요약된 프로토콜은 두 가지 뚜렷한 방법을 설명하며, 각 방법은 개선된 정제 또는 간소화된 단계를 특징으로 합니다. 두 방법 모두 쥐 당 약 0.5 x 108-1 x 108 호중구를 산출했습니다. annexin V-FITC/PI 세포사멸 검출 키트를 사용한 유세포 분석 분석은 생쥐 및 인간과 유사한 90% 이상의 세포 생존율을 보였습니다(그림 1). 골수에서 호중구를 분리하는 동안 림프구 오염이 불가피한 것처럼 보였지만, 2단계 분석법은 1단계 분석법이 달성한 50%에 비해 90%의 향상된 순도 수준을 보여주었습니다(그림 2).
NET 분비에 대한 유사한 반응은 PMA 자극에 관계없이 말초 호중구와 골수 호중구 간에 식별 가능했습니다(그림 3). 또한, 쥐 NET은 서로 제한된.......
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토론
호중구의 분리는 NETosis를 연구하는 데 있어 중추적인 단계를 구성하며, 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해서는 적절한 분리 방법을 선택하는 것이 가장 중요합니다. 고려해야 할 중요한 요소는 격리 중 림프구 오염의 발생입니다. 이 문제를 해결하는 것은 골수에서 쥐 호중구를 분리할 때 특히 중요합니다. 림프구(1.0337-1.0765, 최대 1.0526)에 비해 호중구(1.0814-1.0919, 최대 1.0919)의 뚜렷한 밀도 범위에도 불구하고 림프구의 오염은 피할 수 없습니다. 이는 부분적으로 골수에 림프구가 풍부하고 미성숙 림프구의 밀도가 증가했기 때문인 것으로 볼 수 있다15. Percoll 및 Ficoll을 사용하는 것과 같은 밀도 구배 분리와 같은 기술은 림프구 오염을 억제하는 데 도움이 될 수 있지만 림프구를 완전히 제거하는 것은 어려울 수 있습니다. 특정 밀도 구배로 보정된 특수 Percoll 용액을 사용하여 쥐 호중구와 다른 골수 세포 간의 밀도 차이를 활용하여 오염을 .......
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공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
자금 지원: 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단(Nos. 82004154, 81900311, 82100336 및 81970345)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| A488-활용 당나귀 anti-rabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-활용 당나귀 anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-활용 염소 anti-mouse IgG1 | Invitrogen, 미국 | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, | USA 10104159001 | |
| 소 태아 혈청(FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| 행크 s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, 미국 | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, 미국 | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, 중국 | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, 미국 | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, 중국 | SL050 | |
| 파라포름알데히드 | biosharp, 중국 | BL539A | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Hyclone, 미국 | SV30010 | |
| Percoll | GE, 미국 | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA& | nbsp; P1585 | |
| Picogreen dsDNA 분석 키트 | Invitrogen, 미국 | P11496 | |
| 쥐 호중구 분리 키트 | Solarbio, 중국 | P9200 | |
| 적혈구 용해 완충액 | Solarbio, 중국 | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 매체 | Hyclone, 미국 | SH30809.01B | |
| RWD 범용 동물 마취기 | RWD, 중국 | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) 쥐 | Dashuo, 중국 | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, 미국 | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) 버퍼 | Solarbio, 중국 | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, 독일 | 1139ML100 |
참고문헌
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F.
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재인쇄 및 허가
