यह प्रोटोकॉल इनोकुलम की तैयारी, क्रिस्टल वायलेट डाई का उपयोग करके माइक्रोटिटर प्लेटों पर बायोफिल्म परिमाणीकरण, बायोफिल्म में व्यवहार्य गणना और एसिनेटोबैक्टर के बायोफिल्म के विज़ुअलाइज़ेशन का वर्णन करता है।
एसिनेटोबैक्टर नोसोकोमियल संक्रमण का कारण बनता है और इसका बायोफिल्म गठन अस्पताल के वातावरण जैसी शुष्क सतहों पर जीवित रहने में योगदान कर सकता है। इस प्रकार, बायोफिल्म परिमाणीकरण और विज़ुअलाइज़ेशन नोसोकोमियल संक्रमण पैदा करने के लिए एसिनेटोबैक्टर उपभेदों की क्षमता का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण तरीके हैं। माइक्रोप्लेट की सतह पर बनने वाले बायोफिल्म को मात्रा और सेल संख्या के संदर्भ में निर्धारित किया जा सकता है। बायोफिल्म वॉल्यूम को क्रिस्टल वायलेट का उपयोग करके धुंधला करके, धोने, इथेनॉल का उपयोग करके डिस्टेन करने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, फिर माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके घुलनशील डाई को मापा जा सकता है। बायोफिल्म में एम्बेडेड कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए, बायोफिल्म को सेल स्क्रैपर्स का उपयोग करके खत्म कर दिया जाता है, खारा में काटा जाता है, कांच के मोतियों की उपस्थिति में सख्ती से उत्तेजित किया जाता है, और एसिनेटोबैक्टर एगर पर फैलाया जाता है। फिर, प्लेटों को 24-42 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है। इनक्यूबेशन बाद, बायोफिल्म में कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए लाल कॉलोनियों की गणना की जाती है। यह व्यवहार्य गणना विधि मिश्रित प्रजातियों के बायोफिल्म में एसिनेटोबैक्टर कोशिकाओं की गिनती के लिए भी उपयोगी हो सकती है। फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके एसिनेटोबैक्टर बायोफिल्म की कल्पना की जा सकती है। सूक्ष्म विश्लेषण के लिए डिज़ाइन किया गया एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोप्लेट बायोफिल्म बनाने के लिए नियोजित किया जाता है। फिर, नीचे की सतह से जुड़े बायोफिल्म को SYTO9 और प्रोपिडियम आयोडाइड रंगों से रंगा जाता है, धोया जाता है, फिर कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के साथ कल्पना की जाती है।
एसिनेटोबैक्टर को नोसोकोमियल संक्रमण का कारण माना जाता है, और इसका मानव संक्रमण, विशेष रूप से स्वास्थ्य सुविधाओं में, तेजीसे रिपोर्ट किया जाता है। यह अस्पतालों, स्वास्थ्य सुविधाओं और भोजन से जुड़े वातावरण 2,3,4 में व्यापक है। यह अस्पताल की सतहों जैसे बिस्तर रेल, बेडसाइड टेबल, वेंटिलेटर की सतह और सिंकसहित वातावरण में लंबे समय तक जीवित रह सकता है। पर्यावरणीय सतहों पर इस तरह की दृढ़ता एसिनेटोबैक्टर4 के नोसोकोमियल संक्रमण में योगदान देने वाले महत्वपूर्ण कारकों में से एक हो सकती है।
बायोफिल्म माइक्रोबियल जीवन का एक रूप है और एक माइक्रोबियल मैट्रिक्स है जो जीवित माइक्रोबियल कोशिकाओंऔर कोशिकाओं से बाह्य बहुलक पदार्थों (ईपीएस) से बना है। माइक्रोबियल कोशिकाएं मैट्रिक्स में एम्बेडेड होती हैं और अक्सर पर्यावरणीय तनाव जैसे गर्मी, लवण, सूखापन, एंटीबायोटिक्स, कीटाणुनाशक और कतरनी बलों 6,7 के लिए अत्यधिक प्रतिरोधी होती हैं।
एसिनेटोबैक्टर सतहों पर बायोफिल्म बना सकता है, यह सुझाव देता है कि यह अस्पताल की सतहों सहित पर्यावरणीय सतहों पर विस्तारित अस्तित्व में योगदान दे सकता है, और एंटीबायोटिक उपचार के लिए प्रतिरोध 8,9 को बढ़ा सकता है। इसके अलावा, एसिनेटोबैक्टर का बायोफिल्म गठन मानव नैदानिक परिणामों के साथ अत्यधिक जुड़ा हो सकताहै। इसलिए, एसिनेटोबैक्टर उपभेदों की बायोफिल्म फॉर्मेबिलिटी पर्यावरणीय अस्तित्व और मानव संक्रमण 8,10 की भविष्यवाणी करने में संकेतकों में से एक हो सकती है।
सतह से जुड़े बायोफिल्म को बायोफिल्म फॉर्मेबिलिटी का आकलन करने के लिए परिमाणित और कल्पना की जा सकती है। सतह से जुड़े बायोफिल्म की मात्रा निर्धारित करने के लिए, बायोफिल्म को आमतौर पर क्रिस्टल वायलेट जैसे बायोफिल्म-धुंधला रंगों से दाग दिया जाता है, और रंगों को घोल में संश्लेषित किया जाता है और ऑप्टिकल घनत्व11 के लिए मापा जाता है। बायोफिल्मफॉर्मेबिलिटी का आकलन करने के लिए बायोफिल्म का विज़ुअलाइज़ेशन एक और अच्छा तरीका है। कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) विज़ुअलाइज़ेशन विधि फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके विशिष्टता को नियोजित करती है, एसईएम12,13 जैसी अन्य तकनीकों की तुलना में बायोफिल्म आकृति विज्ञान को चिह्नित करने के लिए अधिक उपयोगी हो सकती है।
बायोफिल्म में व्यवहार्य कोशिकाओं को बायोफिल्म11 में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए गिना जा सकता है। बायोफिल्म में एम्बेडेड व्यवहार्य कोशिकाओं को अलग किया जाता है, पतला किया जाता है, अगर प्लेटों पर फैलाया जाता है, इनक्यूबेट किया जाता है, और गणना की जाती है। क्योंकि कोशिकाओं की अधिक संख्या संक्रामक खुराक को पूरा करने की संभावना है, यह बायोफिल्म पर अधिक विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकता है, जैसे कि कोशिकाओं की संख्या13,14 से जुड़े संक्रमण क्षमता।
यह लेख चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है (1) सतह से जुड़े बायोफिल्म की मात्रा निर्धारित करना, (2) बायोफिल्म में व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करना, और (3) एसिनेटोबैक्टर के सीएलएसएम का उपयोग करके बायोफिल्म की कल्पना करना। प्रस्तुत प्रोटोकॉल एसिनेटोबैक्टर आइसोलेट्स की बायोफिल्म फॉर्मेबिलिटी का आकलन करने और उनके बायोफिल्म को चिह्नित करने के तरीकों का वर्णन करते हैं।
वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, अलग-अलग डिग्री के साथ एसिनेटोबैक्टर आइसोलेट्स के बायोफिल्म गठन को मापा गया, कल्पना की गई, और बायोफिल्म में व्यवहार्य कोशिकाओं का अनुमान लगाया गया (चित्रा 1, चित्र?…
The authors have nothing to disclose.
यह शोध कोरिया खाद्य अनुसंधान संस्थान (केएफआरआई) के मुख्य अनुसंधान कार्यक्रम (E0210702-03) द्वारा समर्थित था, जो विज्ञान और आईसीटी मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित था।
96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |