Acinetobacter Biyofilmleri için Miktar Tayini, Canlılık Değerlendirmesi ve Görselleştirme Stratejileri
Summary
Bu protokol, aşının hazırlanmasını, kristal viyole boya kullanılarak mikrotitre plakalar üzerinde biyofilm miktarının belirlenmesini, biyofilmlerdeki canlı sayımı ve Acinetobacter biyofilmlerinin görselleştirilmesini açıklar.
Abstract
Acinetobacter hastane enfeksiyonlarına neden olur ve biyofilm oluşumu hastane ortamları gibi kuru yüzeylerde sağkalıma katkıda bulunabilir. Bu nedenle, biyofilm ölçümü ve görselleştirme, Acinetobacter suşlarının hastane enfeksiyonlarına neden olma potansiyelini değerlendirmek için önemli yöntemlerdir. Mikroplakanın yüzeyinde oluşan biyofilmler, hacim ve hücre sayıları açısından ölçülebilir. Biyofilm hacimleri, kristal viyole kullanılarak boyanarak, yıkanarak, etanol kullanılarak leke çıkarılarak ve ardından bir mikroplaka okuyucu kullanılarak çözündürülmüş boyanın ölçülmesiyle ölçülebilir. Biyofilmlere gömülü hücrelerin sayısını ölçmek için, biyofilmler hücre sıyırıcılar kullanılarak sıyrılır, tuzlu suda hasat edilir, cam boncukların varlığında kuvvetlice çalkalanır ve Acinetobacter agar üzerine yayılır. Daha sonra plakalar 30 °C’de 24-42 saat inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, biyofilmlerdeki hücre sayısını tahmin etmek için kırmızı koloniler numaralandırılır. Bu uygulanabilir sayım yöntemi, karışık tür biyofilmlerdeki Acinetobacter hücrelerini saymak için de yararlı olabilir. Acinetobacter biyofilmleri, floresan boyalar kullanılarak görselleştirilebilir. Biyofilm oluşturmak için mikroskobik analiz için tasarlanmış ticari olarak temin edilebilen bir mikroplaka kullanılır. Daha sonra, alt yüzeye yapıştırılan biyofilmler SYTO9 ve propidyum iyodür boyaları ile boyanır, yıkanır ve daha sonra konfokal lazer tarama mikroskobu ile görselleştirilir.
Introduction
Acinetobacter’in hastane enfeksiyonlarına neden olduğu bilinmektedir ve özellikle sağlık tesislerinde insan enfeksiyonu giderek daha fazla bildirilmektedir1. Hastanelerde, sağlık tesislerinde ve gıda ile ilişkili ortamlarda yaygındır 2,3,4. Yatak korkulukları, komodinler, vantilatörlerin yüzeyleri ve lavabolar gibi hastane yüzeyleri dahil ortamlarda uzun süre hayatta kalabilir4. Çevresel yüzeylerde bu tür bir kalıcılık, Acinetobacter4’ün hastane enfeksiyonlarına katkıda bulunan önemli faktörlerden biri olabilir.
Biyofilm, mikrobiyal yaşamın bir şeklidir ve canlı mikrobiyal hücrelerden ve hücrelerden hücre dışı polimerik maddelerden (EPS) oluşan mikrobiyal bir matristir5. Mikrobiyal hücreler matrise gömülüdür ve genellikle ısı, tuzlar, kuruluk, antibiyotikler, dezenfektanlar ve kesme kuvvetlerigibi çevresel streslere karşı oldukça dirençlidir 6,7.
Acinetobacter yüzeylerde biyofilmler oluşturabilir, bu da hastane yüzeyleri de dahil olmak üzere çevresel yüzeylerde uzun süreli sağkalıma ve antibiyotik tedavisinekarşı direncin artmasına katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir 8,9. Ek olarak, Acinetobacter’in biyofilm oluşumu, insan klinik sonuçlarıyla yüksek oranda ilişkili olabilir8. Bu nedenle, Acinetobacter suşlarının biyofilm şekillendirilebilirliği, çevresel sağkalımı ve insan enfeksiyonlarını tahmin etmede göstergelerden biri olabilir 8,10.
Yüzeye bağlı biyofilmler, biyofilm şekillendirilebilirliğini değerlendirmek için ölçülebilir ve görselleştirilebilir. Yüzeye bağlı biyofilmleri ölçmek için, biyofilmler normalde kristal viyole gibi biyofilm boyama boyaları ile boyanır ve boyalar çözelti içinde ayrıştırılır ve optik yoğunluk11 için ölçülür. Biyofilmlerin görselleştirilmesi, biyofilm şekillendirilebilirliğini değerlendirmek için başka bir iyi yaklaşımdır11. Floresan boyalar kullanılarak özgüllüğü kullanan konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM) görselleştirme yöntemi, SEM12,13 gibi diğer tekniklere kıyasla biyofilm morfolojisini karakterize etmek için daha yararlı olabilir.
Biyofilmlerdeki canlı hücreler, biyofilmlerdeki canlı hücrelerin sayısını tahmin etmek için sayılabilir11. Biyofilmlere gömülü canlı hücreler ayrılır, seyreltilir, agar plakalarına yayılır, inkübe edilir ve numaralandırılır. Daha fazla sayıda hücrenin enfeksiyöz dozu karşılaması muhtemel olduğundan, hücre sayısı13,14 ile ilişkili enfeksiyon potansiyelleri gibi biyofilmler hakkında daha ayrıntılı bilgi sağlayabilir.
Bu makale, (1) yüzeye bağlı biyofilmleri ölçmek, (2) biyofilmlerdeki canlı hücreleri saymak ve (3) Acinetobacter’in CLSM’sini kullanarak biyofilmleri görselleştirmek için adım adım protokoller sunmaktadır. Sunulan protokoller, Acinetobacter izolatlarının biyofilm şekillendirilebilirliğini değerlendirme ve biyofilmlerini karakterize etme yöntemlerini açıklamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan protokol kullanılarak, değişen derecelerde Acinetobacter izolatlarının biyofilm oluşumu ölçüldü, görselleştirildi ve biyofilmlerdeki canlı hücreler tahmin edildi (Şekil 1, Şekil 2 ve Şekil 3).
Bu protokolde Acinetobacter’in büyümesi için 30 °C ve biyofilm oluşumu için 25 °C olmak üzere iki farklı sıcaklık kullanılmıştır. 30 °C kullanıldı, ç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Bilim ve BİT Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Gıda Araştırma Enstitüsü’nün (KFRI) Ana Araştırma Programı (E0210702-03) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
References
- Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
- Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. Acinetobacter spp. in food and drinking water – A review. Food Microbiology. 95, 103675 (2021).
- Towner, K. J. Acinetobacter: an old friend, but a new enemy. Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).
- Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species. American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).
- Flemming, H. C., et al. The biofilm matrix: multitasking in a shared space. Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. Biofilms: the microbial "protective clothing" in extreme environments. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423 (2019).
- Gedefie, A., et al. Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review. Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).
- Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. Acinetobacter baumannii. Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).
- Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii. New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells. Environmental Research. 213, 113714 (2022).
- Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation. Molecules. 24 (10), 1849 (2019).
- Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates. Pathogens. 9 (8), 630 (2020).
- Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes. Food Microbiology. 109, 104125 (2023).
- Stepanović, S., Ćirković, I., Ranin, L., Svabić-Vlahović, M. Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface. Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).
- Boone, R. L., et al. Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee. BMC Microbiology. 21 (1), 21 (2021).
- Otter, J. A., et al. Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection. Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).
- Ravishankar, S., Juneja, V. K., Yousef, A. E., Juneja, V. K. Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment. Microbial Stress Adaptation and Food Safety. , (2003).
- Dewanti, R., Wong, A. C. L. Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7. International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).
- McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).
- McQueary, C. N., Actis, L. A. Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties. The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).
