Summary

Identification de peptides de petites vésicules extracellulaires à partir de macrophages dérivés de la moelle osseuse

Published: June 30, 2023
doi:

Summary

Ce protocole décrit une procédure permettant d’isoler de petites vésicules extracellulaires des macrophages par ultracentrifugation différentielle et d’extraire le peptidome pour l’identification par spectrométrie de masse.

Abstract

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) sont généralement sécrétées par l’exocytose des corps multivésiculaires (MVB). Ces nanovésicules d’un diamètre de <200 nm sont présentes dans divers fluides corporels. Ces sEV régulent divers processus biologiques tels que la transcription et la traduction des gènes, la prolifération et la survie des cellules, l’immunité et l’inflammation par le biais de leurs cargaisons, telles que les protéines, l’ADN, l’ARN et les métabolites. À l’heure actuelle, diverses techniques ont été mises au point pour l’isolation des sEV. Parmi eux, la méthode basée sur l’ultracentrifugation est considérée comme l’étalon-or et est largement utilisée pour l’isolation des sEV. Les peptides sont naturellement des biomacromolécules de moins de 50 acides aminés de longueur. Ces peptides participent à une variété de processus biologiques ayant une activité biologique, tels que les hormones, les neurotransmetteurs et les facteurs de croissance cellulaire. Le peptidome est destiné à l’analyse systématique des peptides endogènes dans des échantillons biologiques spécifiques par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS). Ici, nous avons introduit un protocole permettant d’isoler les sEVs par ultracentrifugation différentielle et d’extraire le peptidome pour l’identification par LC-MS/MS. Cette méthode a permis d’identifier des centaines de peptides dérivés de sEVs à partir de macrophages dérivés de la moelle osseuse.

Introduction

De petites vésicules extracellulaires (sEV) d’un diamètre inférieur à 200 nm sont présentes dans presque tous les types de fluides corporels et sécrétées par toutes sortes de cellules, y compris l’urine, la sueur, les larmes, le liquide céphalo-rachidien et le liquide amniotique1. Initialement, les sEV étaient considérés comme des réceptacles pour l’élimination des déchets cellulaires, ce qui a conduit à un minimum de recherches au cours de la décennie suivante2. Récemment, de plus en plus de preuves indiquent que les sEV contiennent des protéines, des lipides, des acides nucléiques et d’autres métabolites spécifiques. Ces molécules sont transportées vers les cellules cibles3, contribuant à la communication intercellulaire, à travers laquelle elles participent à divers processus biologiques, tels que la réparation des tissus, l’angiogenèse, l’immunité4 et l’inflammation5,6, le développement tumoral et les métastases 7,8,9, etc.

Pour faciliter l’étude des sEV, il est impératif d’isoler les sEV à partir d’échantillons complexes. Différentes méthodes d’isolement des sEVs ont été développées en fonction des propriétés physiques et chimiques des sEV, telles que leur densité, leur taille de particules et leurs protéines marqueurs de surface. Ces techniques comprennent des méthodes basées sur l’ultracentrifugation, des méthodes basées sur la taille des particules, des méthodes basées sur la capture de l’immunoaffinité, des méthodes basées sur la précipitation des sEV et des méthodes basées sur la microfluidique10,11,12. Parmi ces techniques, la méthode basée sur l’ultracentrifugation est largement reconnue comme l’étalon-or pour l’isolation des sEVs et est la technique la plus couramment utilisée13.

De plus en plus de preuves suggèrent la présence d’une multitude de peptides biologiquement actifs non découverts dans les peptidomes de divers organismes. Ces peptides contribuent de manière significative à de nombreux processus physiologiques en régulant la croissance, le développement, la réponse au stress 14,15 et la transduction du signal16. L’objectif du peptidome des sEVs est de découvrir les peptides portés par ces sEVs et de fournir des indices sur leurs fonctions biologiques. Nous présentons ici un protocole d’isolement des sEVs par ultracentrifugation différentielle, suivi de l’extraction des peptides de ces sEVs pour une analyse plus approfondie de leur peptidome.

Protocol

1. Isolement de petites vésicules extracellulaires REMARQUE : Effectuez toute la centrifugation aux étapes 1.1 à 1.11 à 4 °C. Préparation du sérum de veau fœtal exempt de sEV : Centrifuger le FBS pendant la nuit à 110 000 × g à 4 °C à l’aide d’une ultracentrifugeuse (voir tableau des matériaux) pour éliminer les sEV endogènes. Recueillir le surnageant, le filtrer, le stériliser avec une membrane d’ultrafiltration de 0…

Representative Results

Pour les sEVs isolés par ultracentrifugation différentielle (Figure 1), nous avons évalué leur morphologie, leur distribution granulométrique et leurs marqueurs protéiques selon l’International Society for Extracellular Vesicules (ISEV)17. Tout d’abord, la morphologie des sEVs a été observée par MET, montrant une structure typique en forme de coupe (Figure 2A). NTA a montré que les sEV isolés ét…

Discussion

Lors de l’étude de la fonction des sEV, il est impératif d’obtenir des sEV de haute pureté à partir d’échantillons biologiques complexes afin d’éviter toute contamination potentielle. Diverses méthodes d’isolement des sEVs ont été mises au point13 et, parmi ces méthodes, les méthodes basées sur l’ultracentrifugation différentielle ont montré une pureté relativement élevée des sEV. Dans cette étude, 200 mL de surnageant cellulaire ont été prélevés pendant 6 h, et e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation des sciences naturelles de Chine (3157270). Nous remercions le Dr Feng Shao (Institut national des sciences biologiques, Chine) pour la mise à disposition de l’iBMDM.

Materials

BCA Protein Assay Kit Beyotime Technology P0012
CD9 Beyotime Technology AF1192
Centrifugal filter tube Millipore UFC5010BK
Centrifuge bottles polypropylene Beckman Coulter 357003 High-speed centrifuge
Chemiluminescent substrate Thermo Fisher Scientific 34580
Dithiothreitol Solarbio D8220 100 g
DMEM culture medium Cell World N?A
GRP94 Cell Signaling Technology 20292
High-speed centrifuge Beckman Coulter Avanti JXN-26 Centrifuge rotor (JA-25.50)
Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) National Institute of Biological Sciences, China Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)
Iodoacetamide Sigma l1149 5 g
Microfuge tube polypropylene Beckman Coulter 357448 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge 
nano-high-performance LC system Thermo Fisher Scientific EASY-nLC 1000
Nanoparticle tracking analysis  Malvern Panalytical NanoSight LM10 NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer Thermo Fisher Scientific N/A
Phosphate-buffered saline Solarbio P1020
Polyallomer centrifuge tubes Beckman Coulter 326823 Ultracentrifuge
Protease inhibitor Bimake B14002
SpeedVac vacuum concentrator Eppendorf Concentrator plus
Tabletop ultracentrifuge Beckman Coulter Optima MAX-XP Ultracentrifuge rotor (TLA 55)
Transmission electron microscope HITACHI H-7650B
TSG101 Sigma AF8258
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima XPN-100 Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti)
Ultrasonic cell disruptor Scientz SCIENTZ-IID
Western Blot imager Bio-Rad ChemiDocXRs Image lab 4.0 (beta 7)
β-actin Sigma A3853

References

  1. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
  2. Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
  3. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  4. Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
  5. Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
  6. Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
  7. Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
  8. Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
  9. Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
  10. Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
  11. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  12. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
  13. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  14. Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
  15. Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
  16. Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
  17. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
  18. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  19. Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
  20. Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I. Peptidome: Chaos or inevitability. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13128 (2021).
  21. Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
  22. Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).

Play Video

Cite This Article
Cheng, J., Zhu, J., Liu, Y., Yang, C., Zhang, Y., Liu, Y., Jin, C., Wang, J. Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (196), e65521, doi:10.3791/65521 (2023).

View Video