Identifiering av peptider av små extracellulära vesiklar från makrofager från benmärg
Summary
Detta protokoll beskriver en procedur för att isolera små extracellulära vesiklar från makrofager genom differentiell ultracentrifugering och extrahera peptidomet för identifiering med masspektrometri.
Abstract
Små extracellulära vesiklar (sEV) utsöndras vanligtvis genom exocytos av multivesikulära kroppar (MVB). Dessa nanovesiklar med en diameter på <200 nm finns i olika kroppsvätskor. Dessa sEV reglerar olika biologiska processer såsom transkription och translation av gener, cellproliferation och överlevnad, immunitet och inflammation genom sina laster, såsom proteiner, DNA, RNA och metaboliter. För närvarande har olika tekniker utvecklats för isolering av elfordon. Bland dem anses den ultracentrifugeringsbaserade metoden vara guldstandarden och används ofta för isolering av elfordon. Peptiderna är naturligt biomakromolekyler med mindre än 50 aminosyror i längd. Dessa peptider deltar i en mängd olika biologiska processer med biologisk aktivitet, såsom hormoner, neurotransmittorer och celltillväxtfaktorer. Peptidomet är avsett att systematiskt analysera endogena peptider i specifika biologiska prover med vätskekromatografi-tandem-masspektrometri (LC-MS/MS). Här introducerade vi ett protokoll för att isolera sEV genom differentiell ultracentrifugering och extraherade peptidom för identifiering med LC-MS/MS. Denna metod identifierade hundratals sEVs-härledda peptider från benmärgshärledda makrofager.
Introduction
Små extracellulära vesiklar (sEV) med en diameter på mindre än 200 nm finns i nästan alla typer av kroppsvätskor och utsöndras av alla typer av celler, inklusive urin, svett, tårar, cerebrospinalvätska ochfostervatten. Till en början betraktades elbilar som behållare för bortskaffande av cellulärt avfall, vilket ledde till minimal forskning under detefterföljande decenniet. På senare tid har allt fler bevis visat att sEV innehåller specifika proteiner, lipider, nukleinsyror och andra metaboliter. Dessa molekyler transporteras till målceller3, vilket bidrar till intercellulär kommunikation, genom vilken de deltar i olika biologiska processer, såsom vävnadsreparation, angiogenes, immunitet4 och inflammation5,6, tumörutveckling och metastasering 7,8,9, etc.
För att underlätta studier av elfordon är det absolut nödvändigt att isolera elfordon från komplexa prover. Olika isoleringsmetoder för sEV har utvecklats baserat på de fysikaliska och kemiska egenskaperna hos sEV, såsom deras densitet, partikelstorlek och ytmarkörproteiner. Dessa tekniker inkluderar ultracentrifugeringsbaserade metoder, partikelstorleksbaserade metoder, immunoaffinitetsbaserade metoder, sEVs-utfällningsbaserade metoder och mikrofluidikbaserade metoder10,11,12. Bland dessa tekniker är den ultracentrifugeringsbaserade metoden allmänt erkänd som guldstandarden för isolering av elfordon och är den vanligaste tekniken13.
En ökande mängd bevis tyder på att det finns en mängd oupptäckta biologiskt aktiva peptider i peptidomen hos olika organismer. Dessa peptider bidrar avsevärt till många fysiologiska processer genom att reglera tillväxt, utveckling, stressrespons 14,15 och signaltransduktion16. Syftet med sEVs peptidom är att avslöja de peptider som bärs av dessa sEVs och ge ledtrådar till deras biologiska funktioner. Här presenterar vi ett protokoll för att isolera sEV genom differentiell ultracentrifugering, följt av extraktion av peptider från dessa sEV för vidare analys av deras peptidom.
Protocol
Representative Results
Discussion
När man undersöker funktionen hos sEV är det absolut nödvändigt att uppnå sEV med hög renhet från komplexa biologiska prover för att undvika potentiella kontamineringar. En mängd olika metoder för isolering av sEV har utvecklats13, och bland dessa metoder har differentiella ultracentrifugeringsbaserade metoder visat relativt hög renhet hos sEV. I denna studie samlades 200 ml cellsupernatant in under 6 timmar, och cirka 200-300 μg sEV erhölls genom differentiell ultracentrifugering. D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien finansierades av Natural Science Foundation of China (3157270). Vi tackar Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, Kina) för att ha tillhandahållit iBMDM.
Materials
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
- Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
- Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
- Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
- Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
- Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
- Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
- Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
- Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I. Peptidome: Chaos or inevitability. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13128 (2021).
- Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
- Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).
