Etiketfri overfladeforbedret Raman-spredningsbioanalyse baseret på Au@Carbon priknanosonder

Summary

I denne undersøgelse udviklede vi en billig overfladeforbedret Raman-spredning (SERS) -baseret fingeraftryksnanosonde med gunstig biokompatibilitet for at vise etiketfri levende cellebioimaging og detektere to bakteriestammer, der viser detaljeret, hvordan man får SERS-spektre af levende celler i en ikke-destruktiv metode.

Abstract

Overfladeforbedret Raman-spredningsteknologi (SERS) har tiltrukket sig mere og mere opmærksomhed på det biomedicinske område på grund af dets evne til at levere molekylær fingeraftryksinformation om biologiske prøver samt dets potentiale i enkeltcelleanalyse. Dette arbejde har til formål at etablere en enkel strategi for etiketfri SERS-bioanalyse baseret på Au@carbon dot nanoprobes (Au@CDs). Her anvendes polyphenolafledte cd’er som reduktionsmiddel til hurtigt at syntetisere kerneskal-Au@CD nanostrukturer, hvilket muliggør kraftig SERS-ydeevne, selv når koncentrationen af methylenblåt (MB) er så lav som 10-9 M, på grund af den kooperative ^{Raman-forbedringsmekanisme} . Til bioanalyse kan Au@CDs tjene som en unik SERS nanosensor til at identificere de cellulære komponenter i bioprøver (f.eks. Kræftceller og bakterier). De molekylære fingeraftryk fra forskellige arter kan skelnes yderligere efter kombination med hovedkomponentanalysen. Derudover Au@CDs også muliggøre etiketfri SERS-billeddannelse til analyse af intracellulære sammensætningsprofiler. Denne strategi tilbyder en gennemførlig, etiketfri SERS-bioanalyse, der åbner et nyt perspektiv for nanodiagnose.

Introduction

Enkeltcelleanalyse er afgørende for undersøgelsen af afslørende cellulær heterogenitet og vurdering af cellens omfattende tilstand. Cellens øjeblikkelige reaktion på mikromiljøet garanterer også enkeltcelleanalyse¹. Der er dog nogle begrænsninger for de nuværende teknikker. Fluorescensdetektion kan anvendes til enkeltcelleanalyse, men det er begrænset af lav følsomhed. Andre udfordringer opstår som følge af cellernes komplicerede fluorescensbaggrund og fluorescensfotoblegning under langvarig bestråling². Overfladeforstærket Raman-spredning (SERS) kan kvalificere sig med hensyn til enkeltcelleanalyse på grund af dens fordele, herunder (1) reflektering af den iboende molekylære fingeraftryksinformation og den øjeblikkelige situation, (2) ultrahøj overfladefølsomhed, (3) bekvem multiplexdetektion, (4) høj fotostabilitet, (5) detektion kan kvantificeres til komparativ analyse, (6) undgå cellulær autofluorescens med NIR-bølgelængdeexcitationen, (7) detektion kan udføres i en cellulær vandig miljø, og (8) detektion kan dirigeres til et bestemt område i cellen ^3,4,5.

Der er to bredt anerkendte mekanismer til at forstå SERS som et grundlæggende fænomen: elektromagnetisk forbedring (EM) som en dominerende årsag og kemisk forbedring (CM). EM refererer til, i en given frekvens af det spændende felt, svingningen af kollektive elektroner drevet af elektromagnetiske bølger, når frekvensen af det indfaldende lys matcher frekvensen af frie elektroner, der oscillerer i metallet, hvilket giver anledning til overfladeplasmonresonans (SPR). Når lokaliseret SPR (LSPR) forekommer gennem den indfaldende laser, der rammer metalnanopartiklerne (NP’er), fører det til resonansabsorption eller spredning af det indfaldende lys. Derfor kan overfladen elektromagnetisk feltintensitet af metal NP’er forbedres med to til fem ordrer⁴. Nøglen til den enorme forbedring i SERS er imidlertid ikke en enkelt metal NP, men kløften mellem to NP’er, hvilket skaber hot spots. CM genereres fra to sider, herunder (1) interaktioner mellem målmolekyler og metal-NP’er og (2) målmolekyler, der er i stand til at overføre elektroner til / fra metal-NP’er ^4,5. Mere udtømmende detaljer findes i disse oversigtsartikler ^4,5. Flere lovende metoder til SERS biosensing og billeddannelse i levende celler er blevet præsenteret i tidligere litteratur, for eksempel påvisning af apoptotiske celler⁶, proteiner i organeller⁷, intracellulære miRNA’er⁸, cellulære lipidmembraner,9 cytokiner 10 og metabolitter ¹¹ i levende celler samt identifikation og overvågning af celler ved konfokal SERS-billeddannelse ^{2, 11,12,13}. Interessant nok præsenterer etiketfri SERS den unikke fordel ved SERS, som kan beskrive interne molekylære spektre⁵.

Et stort problem for etiketfri SERS er et rationelt og pålideligt substrat. Typiske SERS-substrater er ædelmetal NP’er på grund af deres fremragende evne til at sprede meget lys¹⁴. I dag lægges der mere og mere vægt på nanokompositter på grund af deres bemærkelsesværdige fysiske og kemiske egenskaber og biokompatibilitet. Mere markant kan nanokompositter vise bedre SERS-aktivitet på grund af den intense EM induceret af hot spots på nanohybriderne og yderligere kemisk forbedring, der stammer fra andre ikke-metalmaterialer¹⁵. For eksempel brugte Fei et al. MoS 2 kvantepunkter (QD’er) som reduktionsmidler til at syntetisere Au_{NP@MoS 2} QD nanokompositter til etiketfri nær-infrarød (NIR) SERS-billeddannelse af mus 4T1 brystkræftcelle (4T1-celler)¹⁶. Li et al. fremstillede også et 2D SERS-substrat bestående af Au NP’er og 2D hafniumditelluridnanoark til etiketfri SERS-målinger af fødevarebårne patogene bakterier¹⁷. For nylig er kulstofprikker (CD’er), gode elektrondonorer, blevet brugt som reduktionsmidler uden andre reduktionsmidler eller bestråling til at syntetisere Au@carbon dot nanoprober (Au@CDs)¹⁸, som er rapporteret at være effektive materialer til at forbedre SERS-aktiviteten baseret på ladningsoverførselseffekten (CT) mellem Au-kerner og CD-skaller ^19,20. Mere end det anerkendes cd’er som capping agent og en stabilisator for at forhindre Au NP’er i at aggregere²¹. Derudover åbner det flere muligheder for reaktioner med analysander, da det kan give et stort antal bindende og aktive steder²⁰. Ved at udnytte ovenstående udviklede Jin et al. en hurtig og kontrollerbar metode til fremstilling af Ag@CD NP’er med unikke SERS-egenskaber og fremragende katalytiske aktiviteter til overvågning af heterogene katalytiske reaktioner i realtid¹⁸.

Heri blev der demonstreret en let og billig metode til fremstilling af kerneskal- Au@CD SERS-substrater til identifikation af cellulære komponenter og etiketfri SERS levende cellebilleddannelse samt til at detektere og differentiere Escherichia coli (E. coli) og Staphylococcus aureus (S. aureus), som lover godt for tidlig diagnose af sygdom og en bedre forståelse af cellulære processer.

Protocol

1. Fremstilling af Au@CDs BEMÆRK: Figur 1 illustrerer en fabrikationsprocedure for Au@CDs. Forbered CD-opløsning ved hjælp af citronsyre (CA) og gallinsyre (GA) via en typisk hydrotermisk behandlingsprocedure18. Der tilsættes 100 μL 3,0 mg ml-1 af den tilberedte CD-opløsning i 200 μL 10 mM chloraurinsyre (HAuCl4) (se materialetabellen) ved stuetemperatur i 10 …

Representative Results

Fremstilling af Au@CDs er illustreret i figur 1. CD’erne blev fremstillet fra CA og GA via en typisk hydrotermisk proces18. Au@CDs blev hurtigt syntetiseret ved at reducere HAuCl4 med cd’er i vandige medier ved stuetemperatur. Størrelsen og morfologien af cd’er og Au@CDs kan observeres af TEM og højopløsnings-TEM23. De forberedte cd’er er monodisperserede med små størrelser på næsten 2-6 nm (<strong c…

Discussion

Sammenfattende er Au@CDs med en ultratynd cd-skal på 2, 1 nm blevet fremstillet med succes. Nanokompositterne viser overlegen SERS-følsomhed end rene AU-NP’er. Au@CDs også have fremragende ydeevne i reproducerbarhed og langsigtet stabilitet. Yderligere forskning omfatter at tage Au@CDs som substrater til at udføre SERS-billeddannelse af A549-celler³¹ og til at detektere to bakteriestammer³². Det er bevist, at Au@CDs kan bruges som en ultrafølsom SERS-sonde, hovedsageli…

Materials

10x PBS buffer (Cell culture)	Langeco Technology	BL316A
6 well cell culture plate	LABSELECT	11110
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	GLPBIO	GK10001
Citric acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	C108869
CO2 incubator	Thermo Fisher Technologies	3111
Constant temperature magnetic agitator	Sartorius Scientific Instruments	SQP
Cryogenic high speed centrifuge	Shanghai Boxun	SW-CJ-2FD
DMEM high glucose cell culture medium	Procell	PM150210
Electronic balance	Sartorius Scientific Instruments	SQP
Enzyme marker	Thermo Fisher Technologies	3111
Fetal bovine serum	Zhejiang Tianhang Biological Technology	11011-8611
Figure 1	Figdraw.
Fourier infrared spectrometer	Thermo, America	Nicolet 380
Freeze dryer	Tecan	Infinite F50
Gallic acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	G104228
Handheld Raman spectrometer	OCEANHOOD, Shanghai, China	Uspectral-PLUS
HAuCl4	Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou)
High resolution transmission electron microscope	Thermo Fisher Technologies	FEI Tecnai G2 Spirit T12
High temperature autoclave	Shanghai Boxun	YXQ-LS-50S
Inverted microscope	Nanjing Jiangnan Yongxin Optical	XD-202
LB Broth BR	Huankai picoorganism	028320
Medical ultra-low temperature refrigerator	Thermo Fisher Technologies	ULTS1368
Methylene blue	Sigma-Aldrich
Pancreatin Cell Digestive Solution	beyotime	C0207
Penicillin streptomycin double resistance	Shanghai Boxun	YXQ-LS-50S
Pure water meter	Millipore, USA	Milli-Q System
Raman spectrometer	Renishaw
Sapphire chip	beyotime
Thermostatic water bath	Changzhou Noki
Ultra-clean table	Shanghai Boxun	SW-CJ-2FD
Uv-visible light absorption spectrometer	MADAPA, China	UV-6100S
Wire 3.4	Renishaw